不同季节新鲜鸭蛋表面污染细菌的多样性分析

卢昌丽，熊香元，龚慧可，任佑华，陈力力*，刘 焱*

（湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

据报道2019年我国禽蛋产量高达3 308.98万 t，其中鸭蛋约占禽蛋总量的20%，鸭蛋生产已成为我国禽蛋的重要组成部分[1]。鸭蛋富含蛋白质、磷脂、磷脂、VA、VB2、VB1、VD、矿物质及人体必需氨基酸等营养物质[2-3]。《医林纂要》记载，鸭蛋补心清肺，止热嗽，治喉痛。百沸汤冲食，清肺火，解阳明结热[4]。长期以来鸭蛋备受消费者的喜爱，近十年数据统计表明，人们对禽蛋的需求量逐年递增[5]。同时，鲜鸭蛋的质量与卫生直接关系到消费者的食用安全，因此也备受关注[6]。

鸭的生活习性喜水、好合群，人们常利用江河、湖泊、水塘等天然养殖场，采用放养、散养的饲养方式[7]。鸭的腹大腿短，臀部丰满且略下垂，羽毛容易受环境污染[8]；另外鸭下蛋无固定场所，使蛋壳表面很容易黏有污泥、垫草、粪便，导致细菌生长繁殖；随着贮藏时间延长，蛋壳表面的细菌能经过蛋壳上的气孔水平传播进入蛋内，在条件适宜时会大量生长繁殖[9]。前期研究表明鸭蛋壳表面带菌数在106以上，其表面菌落总数与同一环境中饲料、垫草及空气的菌落总数呈正相关[10]。

由于一年四季的气温、湿度、降雨量、光照等气候条件有所不同，因此，不同季节生产的鸭蛋卫生品质也有所差别[11]。高通量测序技术作为近十年发展最迅猛的生物技术，因其相对于传统培养和国标法具有高覆盖度、高灵敏度、高准确性和低成本等特点，在食品微生物生态学研究中被广泛应用，目前已在分析食品微生物多样性、评价食品发酵和贮藏过程中微生物群落结构变化、监测食源性病原菌动态特征以及控制食品质量等方面发挥出无可比拟的优势[12]。张雅靖等[13]采用Illumina高通量测序方法，对撒坝火腿表面和内部细菌的16S rDNA V3-V4区和真菌ITS2区进行扩增和测序，分析群落构成和多样性，结果表明样品细菌的丰度及多样性高于真菌，且内部真菌和细菌微生物多样性和丰度均高于表面，并且发现曲霉和葡萄球菌是撒坝火腿表面和内部的优势菌群。Mu Yu等[14]利用Illumina MiSeq平台进行盘县火腿加工过程中的微生物群落分析时，同样得出细菌群落比真菌群落更为复杂的结论。毛俊龙等[15]为了探究茶黄素对低温贮藏大黄鱼表面附着微生物组成的影响，对不同处理大黄鱼表面附着微生物进行基因组DNA提取及高通量测序、多样性指数分析比较，证明0.3 mol/L茶黄素对冷藏和冻藏大黄鱼分别进行浸泡处理，相较于空白处理和0.3 mol/L VC溶液浸泡处理而言，具有较好的抗氧化性，对脂肪含量较高的大黄鱼表面微生物菌落组成有一定的影响，可以抑制部分菌属生长，延长大黄鱼贮藏时间。本实验拟通过Illumina MiSeq高通量测序技术分析春夏秋冬不同季节鸭蛋壳表面细菌的多样性，从多样性指数、不同分类水平物种种群及丰度的差异性和相似性比较季节因素对鸭蛋表面细菌污染的影响，为鸭蛋的洁蛋、保鲜以及加工过程中相关措施的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从洞庭湖区定点养殖场分别在春、夏、秋、冬季节（3月、6月、9月、12月），参照国家“兽药残留抽样检测技术操作要点”的抽样办法[16]，定期采集新鲜鸭蛋80 枚，分别装入无菌采样袋，带回实验室并在12～20 h内处理。

细菌基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；无菌采样袋（229 mm×140 mm） 北京士博瑞科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1704467 琼脂糖凝胶电泳仪 美国Bio-Rad公司；ABI GeneAmp9700型PCR仪 爱普拜斯公司；SP-752紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Quanti Fluor TM-ST蓝色荧光定量系统 普洛麦格（北京）生物技术有限公司；MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

随机从每批样品鸭蛋中抽取20 枚，各加入100 mL无菌生理盐水，常温条件下置于超声波清洗器中处理50 s，收集洗蛋水混合液作为春夏秋冬四季的样品（Y1、Y2、Y3、Y4），随后将4 个混合液样品各分为4 份，编号LY1、DY1、HY1、YY1春季样品；LY2、DY2、HY2、YY2春季样品；LY3、DY3、HY3、YY3春季样品；LY4、DY4、HY4、YY4春季样品。备用。

1.3.2 细菌总基因组DNA提取

上述16 个样液各取5 mL收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书抽提出总的基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的完整性后，利用紫外分光光度计测定OD260，得到DNA浓度，并考察OD260/OD280。

1.3.3 PCR序列扩增和Illumina MiSeq测序

过滤总序列中不合格的DNA模板，对合格的文库根据Illumina MiSeq测序区域（V4+V5），采用合成带有barcode的特异引物进行细菌16S rDNA PCR扩增，引物分别为Primer 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和Primer 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。将PCR产物经胶回收纯化，高通量测序工作上海美吉生物工程有限公司完成。

1.4 数据整理与统计分析

根据barcode序列区分各个样本reads。然后去除嵌合序列，得到可用于后续分析的有效数据，即Clean reads。用相应的软件进行细菌操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）（在97%的相似水平下）聚类分析和绘制稀释曲线；α多样性指数分析，包括有计算菌群丰度指数Chao和ACE，菌群多样性指数Shannon和Simpson，测序深度指数覆盖率。基于以上数据分析的合理性，用Venn图统计多个样本中共有和独有的OTU数目，再一步进行UniFrac的主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA），差异性和相似性；分析门、科、属和种各水平上物种组成的丰度和多样性，将聚类后属水平上的数据表示在热图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。

2 结果与分析

2.1 Illumina MiSeq测序数据统计与质量分析

样品总基因组DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，电泳目的条带清晰，OD260/OD280比值表明其浓度和纯度均符合用于PCR扩增。通过对16 个样品的PCR扩增产物进行Illumina MiSeq测序，共获得697 244 条优化序列，按97%的相似度聚类后归为650 个OTU，包括35 个门，298 个属。随机抽取样品基因组中一定数量的序列个数与它们所代表的物种数目构建稀释曲线，如图1所示，稀释曲线逐渐趋于平坦，说明测序数量足够充分合理，可以进行下一步的数据分析。

图1 相似度为97%条件下各样品的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of each sample at similarity of 97%

2.2 细菌群落的多样性分析

2.2.1α多样性分析

如表1所示，样本中序列被测出的概率高达99%，说明该数据能有效代表样本中微生物的真实情况。冬季样品Y4组（LY4、DY4、HY4、YY4）的ACE指数和Chao指数值最大，平均分别为587.5±17.82和596.5±22.29，菌群丰度明显高于其他3 组季节样品；Shannon指数最大和Simpson指数最小，平均分别为3.52±1.02和0.1±0.07，种群复杂度表现最为突出。不同季节的菌群多样性排序为Y4（冬季样品）＞Y1（春季样品）＞Y2（夏季样品）＞Y3（秋季样品），其中HY4菌群多样性最高。

表1 α多样性指数Table 1 α-Diversity index

2.2.2 Venn图分析

Venn图可用于统计多个样本在相似水平为97%下所共有和独有的物种OTU数目，可以比较直观地表现样本的物种数目组成相似性及重叠情况。由图2可知，4 组样品有35 个共有OTU，分别占各样品OTU数目的0.06%～70%，重叠度较小，说明各个季节鸭蛋壳表面的菌群种类具有较大的差异性。独有的OTU数目分别为Y1 9 个、Y2 0 个、Y3 17 个、Y4 496 个，在Y1独有的OTU中占比最大的为变形杆菌门（Proteobacteria）的淤泥假单胞菌（Pseudomonas_caeni），有研究表明淤泥假单胞菌是抗生素耐药基因的主要宿主菌[17]，会加速耐药致病菌的产生；Y3中丰度较大是水中最为常见细菌之一弧菌属（Vibrio），可引起肠道感染的细菌，它会引发肠胃炎和霍乱等疾病[18]；Y4主要有Candidate_division_SR1门，变形菌门的β-变形菌纲脱氯菌属（Dechloromonas）属于反硝化细菌可以抑制植物性致病菌，梭状芽孢杆菌的小纺锤状菌属（Fusibacter）和拟杆菌门的Bacteroidetes_vadinHA17科等其他微生物共同作用下降解为反硝化过程提供碳源的物质[19]。湖南冬季气温较低，阴湿多雨，气候环境并不适宜细菌繁殖，但冬季鸭群喜聚团保暖，不常活动，使鸭子抵抗力降低，另由于环境卫生等因素造成鸭蛋表面微生物菌群复杂。而夏季高温少雨，暑热时期长，紫外照射时间长，鸭子天热时经常下水，鸭体较为干净，活动较为分散，减少相互之间的细菌滋生。

图2 不同季节样品共有和独有OTU Venn图Fig.2 Venn diagram of unique and shared OTUs of the bacterial communities in different seasons

2.2.3 基于UniFrac的PCoA

首先结合样本OTU的种类及其相对丰度，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果为数据矩阵的一个旋转，它没有改变样本点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。UnifracPCoA基于进化距离，在进化水平上挖掘影响样品群落组成差异的潜在主成分，绘制PCoA聚类图。PC1的贡献率为70.14%，PC2的贡献率为15.12%，当PC1和PC2的总解释度达40%就可用于后续的样品差异性分析。由图3可知，16 个样品中，每个季节的样品组聚类效果均较优，其中春季（Y1）组和夏季（Y2）组的样品相互聚类到一起，而其他组别均出现明显差异。整体来看，组内菌群差异不显著，但组间菌群丰度差异显著。

图3 基于UniFrac的PCoA聚类分析Fig.3 PCoA clustering analysis based on UniFrac

2.3 样品物种组成分析

2.3.1 门和科水平物种组成分析

本研究共注释得到35 个门，其中绝大多数是厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），分别占比59%和38%，其余的33 个门水平物种不到3%。在科分类水平上，共得到200 个科，图4为各样品相对丰度大于1%的科水平物种的多样本柱状图（相对丰度低于1%的部分合并为other）。在4 组样品中占比较大的有5 个科，分别为肠杆菌科（Enterobacteriaceae）占比28.22%（18.53%～33.34%），杆菌科（Bacillaceae）占比17.77%（10.20%～25.42%），肠球菌科（Enterococcaceae）占比17.18%（12.41%～23.63%），梭菌科_1（Clostridiaceae_1）占比9.21%（4.20%～15.45%），扁球菌科（Planococcaceae）占比6.41%（3.19%～8.85%）。

图4 不同季节多样品科水平菌种群组成图Fig.4 Phylum-level composition of microflora in different seasons

2.3.2 属水平物种相对丰度及热图分析

物种组成分析显示，大部分OTUs都可以注释到属水平。为了解菌群的分布情况，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，统计在属分类水平上每个样品的菌群组成，共得到298 个属，其中Y1拥有49 个属，Y2拥有32 个属，Y3有85 个属，Y4有285 个属。由表2可知，各样品的优势菌属，其中Y1埃希氏菌属-志贺菌属（Escherichia-Shigella）相对丰度最大（25.61±10.42）%；Y2肠球菌属（Enterococcus）相对丰度最大（19.74±9.31）%；Y3和Y4的芽孢杆菌属（Bacillus）相对丰度最大，分别为（25.42±18.16）%和（18.27±14.09）%。这说明气温对芽孢杆菌属无明显影响，在蛋壳表面普遍存在，但气温对志贺菌影响显著，过高（Y2）或过低（Y4）都能抑制其生长。Y4的others（即相对丰度低于1%）物种占比为（22.53±20.01）%，说明其物种多样性明显高于其他3 组样品。此外在属水平上发现有肠杆菌（Enterobacter）、溶菌杆菌（Lysinibacillus）、梭菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、厌氧杆菌（Aneurinibacillus）等普通方法难以分离鉴定的细菌序列。

表2 不同季节属水平样品相对丰度分布统计Table 2 Statistics of relative abundance distribution at genus level in different seasons

热图可以用颜色变化反映样品物种丰度的数据信息，直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示，如图5所示，颜色由蓝色到红色分别代表相对丰度为0%～50.53%。通过颜色的梯度及相似程度，能更清晰地反映各样品属水平上群落结构的相似性和差异性。图5中冬季（DY4、HY4、LY4、YY4）样品中的颜色明显比其他3 组偏绿，说明其菌群的相对丰度高于其他3 个季节的菌群丰度，且物种多样性也明显比其他3 组高。从横向看样品中有不同深浅颜色的深绿色、亮黄色到红色，表示这些菌群在样品之间有较高的相似度，虽然存在颜色差异，丰度有些许不同，但也说明它们是样品中普遍存在的群落，都含有梭状芽孢杆菌1型属（Clostridium_sensu_stricto_1）、肠杆菌属（Enterobacter）、埃希氏菌属-志贺菌属（Escherichia-Shigella）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、消化链球菌属（Peptoclostridium）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）[20]。在其他某些蓝色的区域出现，则说明只是一部分的菌属或样品具有相似度，例如，酸性氨基杆菌属（Acidaminobacter）、未分类禽杆菌（Rhodocyclaceae_unclassified）和拟杆菌（Marinilabiaceae）仅Y4中有存在草绿色区域，其他均为蓝色；禽杆菌科（Rhodocyclaceae）的陶厄氏菌属（Thauera）和Parcubacteria_norank在Y3和Y4为黄绿色区域，其他均为蓝色，说明两两菌属之间具有较高的丰度相似度，但样品间的差异极大。

图5 不同季节的样品属水平热图Fig.5 Heatmap showing bacterial community structure at genus level in different seasons

2.3.3 种水平物种组成分析

在种水平上，16 个样品能鉴定出447 个种，其中Y1拥有62 个种，Y2拥有39 个种，Y3有109 个种，Y4有427 个种，但各个种的丰度都较小，而且大部分为没有得到明确种的分类（unclassified）。如表3所示，列出各组样品在种水平上总序列数大于700的物种，其主要为未分类芽孢杆菌（Bacillus_unclassified）、未分类埃希氏菌属-志贺菌属（Escherichia-Shigella_unclassified）、未分类肠球菌（Enterococcus_unclassified）、产气荚膜梭菌（Clostridium_perfringens_NCTC_8239）和未分类肠杆菌（Enterobacter_unclassified），与在属水平分析的物种组成结果差异不大。结果表明，从种水平上看，不同季节的样品各相同物种序列数差异大且多样性更为复杂，在表中样品细菌种类多但丰度小难以进行明确的分类。

表3 不同季节样品种水平物种组成Table 3 Bacterial community composition at genus level in different seasons

3 讨 论

目前对于禽蛋类壳表面细菌的菌群结构研究大部分以鸡蛋为主[21]，而鸭蛋表面的细菌菌群多样性分析较少。这是因为，尽管资料表明，从蛋白质方面看鲜鸭蛋及其制品的营养价值与鲜鸡蛋相当，甚至在脂肪和矿物质含量上优于鸡蛋，可作为鸡蛋的有益补充，完善膳食结构[22]，但消费者对鸡蛋的认知度高、需求量大，鸡蛋的产销量高于鸭蛋，鸡蛋更容易成为人们研究的热点；另外，长期以来，鸭蛋多被生产加工成皮蛋和咸蛋等蛋制品；鸭蛋的污染菌种类多而复杂，普通的菌落计数培养基无法观察到，比如硝化螺旋菌门[23]（Nitrospirae）、米氏硫胺素芽孢杆菌（Aneurinibacillus）等有着严格的培养要求，其深入研究有一定难度[24]。由于鸭的生活习性与鸡有差别，2 种禽蛋壳被污染的菌群有一定区别，石一等[25]从3 个不同养殖场取样分析鸡蛋壳表面多样性结果得出其表面细菌以厚壁菌门和放线菌门为主。从本实验不同季节鸭蛋壳表面的细菌菌群多样性分析结果表明，鸭蛋壳表面菌群35 个门，其中最主要的是厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），比鸡蛋壳物种丰度高些。

在生产过程中，蛋鸭自身感染是鸭蛋壳表面污染菌的影响因素之一，养殖场会在秋季人工强制的方法让母鸭换羽[26]，使鸭短期内还能继续产蛋，这会导致鸭子身体虚弱，入冬时天气湿冷，导致病鸭增多，因此产蛋少且质量不好。本实验的菌群多样性分析出有部分肠道致病菌：芽孢杆菌是导致食品腐败的主要因素之一[27]；肠球菌是一类存在于人和动物消化道内的致病菌，其中粪肠球菌能破坏肠道内DNA，同时产生一定的有害化学物质，诱发直肠癌[28]；埃希氏菌属-志贺菌属也是一种肠道致病菌，引起细菌性痢疾[29]。测序结果中还发现：梭菌是严格厌氧菌属，很难分离培养，与长期使用抗生素有关[30]，易引发炎症；假单胞菌致腐败能力强，存在于粪便和肉类产品中[31]；产碱菌属存在于水和土壤以及脊椎动物肠道中，是常见的专性好氧型寄生菌，易受感染；还有一部分没能明确属水平的肠杆菌科等。

禽蛋壳表面细菌的微生态系统是受多个因素影响的结果，杨伊磊等[32]采用细菌菌落总数进行测定，得出结果认为造成禽蛋表面细菌污染的主要原因均受饲养场的空气、饲料、垫草的细菌污染。Shi Yi等[33]对不同面积，不同贮藏时间的鸡蛋蛋壳微生物群研究，认为蛋壳上微生物群的结构、丰度和组成因不同环境和不同时期而异。姜慧绘等[34]研究不同天气对新鲜鸭蛋蛋壳的细菌污染情况，实验表明在阴冷潮湿天气条件下，新鲜鸭蛋蛋壳细菌群落总数、大肠菌群数不同程度高于晴朗高温天气。与本实验聚类热图分析的冬季（Y4）菌群相对丰度高于其他3 个季节的结果相似。

4 结 论

以不同季节鸭蛋蛋壳洗液样品为研究对象，通过Illumina MiSeq测序技术对样品壳表面中细菌16S rRNA基因进行测序，从稀释性曲线证明本实验的测序结果具有代表性和真实性。结果表明，16 个样品均具有较高的菌群多样性，且各个时期都有相似的优势菌属：厚壁菌门的芽孢杆菌属和肠球菌属，分别占比17.78%和17.16%；变形菌门的埃希氏菌属-志贺菌属占比17.14%。季节变化对鸭蛋表壳的菌群结构有一定影响。芽孢杆菌和肠球菌在秋季相对于春季的丰度高些，而大肠杆菌属-志贺菌属受季节气温影响最为明显，在冬季减少，来年春季气温上升并生长迅速，夏季气温继续升高而丰度降低，秋季时丰度增高。夏季和秋季样品的多样性较低，但其优势菌种的相对丰度较高，占比可达80%。冬季样品的蛋壳表面细菌菌群多样性和相对丰度最高，也最为复杂，更有研究表明蛋壳的污染菌会侵入蛋内容物，冬季产蛋加大造成污染的风险，要在冬季时加强产蛋鸭的营养需求和生产管理。综上所述，本实验在门、科、属和种水平上全面地分析鸭蛋表面细菌的多样性以及其季节性变化，分析表面细菌对鸭蛋腐败变质的潜在影响，强调了养殖场按季节变化分期管理和定期卫生管理的重要性，为进一步禽蛋污染研究提供一定参考。