黑果枸杞化学成分的UPLC-Triple TOF/MS分析及其总花色苷类含量测定

甘小娜，王辉俊，李廷钊，李 波,*

（1.安利（中国）研发中心，上海 201203；2.上海中医药大学中药研究所，上海 201203）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurry）为茄科枸杞属植物，主要产区分布在我国青海、甘肃、新疆等地，因其果实具有独特的营养价值和保健功能而广为人知。黑果枸杞含有多糖、黄酮、生物碱、类胡萝卜素及微量元素[1-4]等，在西北地区是一种著名的药用浆果，多年来一直被用于民间传统医药；据藏药经典《晶珠本草》记载，黑果枸杞可用于治疗心脏病、月经不调及更年期等疾病[5]；现代科学研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗疲劳、抗辐射、抗痛风、改善记忆[6-10]等功能。

花色苷是一类广泛分布于植物花瓣、果实中的水溶性色素，具有良好的抗氧化能力[11]，其清除自由基的能力甚至大于常见的抗氧化剂如VE、儿茶素、槲皮素和丁基羟基茴香醚[12]。另外花色苷还具有抗肿瘤、抗心血管疾病等多种生物活性，已被建议应用于植物产品的质量评价[13]。黑果枸杞因含有丰富的花色苷类成分，民间称之为“花色苷之王”。目前黑果枸杞中活性成分的定量分析主要集中在多酚类和花色苷类成分上，主要采用pH示差法、超高效液相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法[14-18]。pH示差法操作简单，但只能用于总花色苷的评价，无法评估单个化合物的含量；定量质谱灵敏度高、选择性好，但其对流动相的选择范围相对较窄，且对植物提取物的分析来讲，定量质谱的使用和维护成本较高；超高效液相色谱分离效率高、分析速度快、应用范围广，已被广泛运用于不同的领域[19-20]。本研究采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术，对黑果枸杞中化合物进行推断；使用超高效液相色谱，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品，采用半定量的方式，建立黑果枸杞干果中总花色苷类成分的定量分析方法，并收集23 批市场上不同来源的样品进行测定分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品由安利（中国）研发中心提供，由安利（中国）研发中心李波博士鉴定，编号分别为HGQ-1～HGQ-23，存放于安利（中国）研发中心样品库。全部样品经鉴定为茄科植物黑果枸杞Lycium ruthenicumMurray的果实，详细信息见表1。

表1 样品信息Table 1 Information about samples tested in this study

甲酸（色谱纯） 美国Honeywell公司；甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、三氟乙酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；盐酸（分析纯） 上海泰坦科技股份有限公司；超纯水由美国密理博Milli-Q超纯水仪制备；其他试剂均为分析纯。对照品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（纯度≥98%） 上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱配二极管阵列检测器、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）美国Waters公司；1290 UPLC超高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；Triple TOF®4600高分辨质谱美国AB SCIEX公司；WF-600EHT型超声波清洗机宁波海曙五方超声设备有限公司；XS2051/10电子天平梅特勒-托利多国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞中化学成分分析

1.3.1.1 色谱及质谱条件

色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温25 ℃；进样量2 μL；流动相A为10%甲酸溶液，流动相B为甲酸-水-甲醇-乙腈（1∶5∶2∶2，V/V）；流速0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～9 min，85%～80% A，15%～20% B；9～20.5 min，80%～65% A，20%～35% B；20.5～25 min，65%～85% A，35%～15% B。

质谱条件：电喷雾离子源；一级质谱参数为质量扫描范围m/z50～1 700；雾化气压力50 psi；气帘气压力35 psi；离子源电压5 000 V；离子源温度500 ℃；去簇电压100 V；碰撞能量10 eV。二级质谱参数为质量扫描范围m/z50～1 250；去簇电压100 V；碰撞能量40 eV；碰撞能量摆幅20 eV。

1.3.1.2 供试品溶液的制备

取黑果枸杞干果适量，于液氮中速冻2 min，快速转移至打粉机中进行粉碎，取粉末于冷冻干燥机中进一步脱水，得疏松干燥的黑果枸杞粉末。

精密称取黑果枸杞粉末约200 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加入2%甲酸-甲醇溶液10 mL，冰浴超声20 min，静置15 min，加10%甲酸溶液定容，摇匀，溶液用0.22 μm有机滤膜过滤，待用。

1.3.2 黑果枸杞中花色苷类成分的含量测定

黑果枸杞花色苷类成分的色谱定量分析大多采用半定量方法，标准品主要有氯化锦葵素-3,5-O-二葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷[15-16]。本实验参考文献[16]，选择矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，考察其在本实验条件下的稳定性，结果表明标准品溶液在4 ℃条件下11 d内稳定性良好，Y=kX+b为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量浓度与峰面积标准曲线方程；黑果枸杞的总花色苷含量以该化合物为参考，按下式计算：

式中：A总为供试品中所有花色苷的峰面积之和；b为标准曲线方程的截距；V为供试品的体积/mL；k为标准曲线方程的斜率；M为供试品的质量/mg。

1.3.2.1 色谱条件

Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温25 ℃；进样量2 μL；检测波长530 nm。流动相A为0.1%三氟乙酸-10%甲酸溶液，流动相B为甲酸-水-甲醇-乙腈（1∶5∶2∶2，V/V），洗脱梯度程序同1.3.1.1节。

1.3.2.2 标准品溶液的制备

精密称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷适量，置于5 mL棕色容量瓶，加2%盐酸-甲醇溶液定容，摇匀，待用。

1.3.2.3 供试品溶液的制备

精密称取黑果枸杞粉末200 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加入2%盐酸-甲醇溶液10 mL，冰浴超声20 min，静置15 min，加10%磷酸溶液定容，摇匀，溶液用0.22 μm有机滤膜过滤，待用。

1.4 数据处理

数据采集和分析软件分别为Analyst 1.7.1、Peakview 1.2.0.3、Empower 3FR4和Excel 2016。

2 结果与分析

2.1 系统方法的优化

2.1.1 样品干燥方法的选择

花色苷类成分化学性质不稳定，高温对其稳定性影响显著[21-22]。本实验采用液氮速冻即时粉碎及冷冻干燥的方法，实现黑果枸杞样品的低温粉碎和干燥，得到疏松干燥、流动性好的粉末，避免了长时间粉碎产生的热量对样本可能造成的影响，也减小了在普通粉碎后样品易粘的状态对称样造成的误差。

2.1.2 提取方法的选择

花色苷类化合物在酸性条件下比较稳定[23-24]，因此，本实验采用高浓度的盐酸-甲醇溶液对样品进行提取。前期比较使用同体积2%甲酸-甲醇溶液与2%盐酸-甲醇溶液对黑果枸杞粉末进行提取，前者的提取率约为后者的90%，见图1；另外，为避免超声发热对化合物稳定性的影响，在提取时采用冰浴超声的方式。

图1 黑果枸杞不同溶剂提取物色谱图Fig.1 Liquid chromatograms of different solvent extracts of LRM

2.1.3 流动相的选择

流动相中添加三氟乙酸，对花色苷类成分的分离度有明显改善，因此本实验在用液相色谱定量分析黑果枸杞花色苷类成分时加入了三氟乙酸；然而为避免不挥发性试剂对质谱仪造成损耗，在定性鉴别实验中，样品制备时将定量分析前处理中的盐酸及磷酸替换为甲酸，并去掉了流动相A中的三氟乙酸。

2.2 黑果枸杞化学成分的鉴定

取供试品溶液按上述条件进行分析，得到黑果枸杞样品的质谱图（图2）。分别对其中的质谱峰进行分析，根据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，对黑果枸杞中的化合物进行推断，共鉴定出30 个化合物，其中花色苷类成分13 个，生物碱类成分13 个，结果见表2。

表2 黑果枸杞化学成分质谱鉴定信息Table 2 Mass spectral data of identified compounds in LRM

图2 黑果枸杞化学成分的总离子流图Fig.2 Total ion current chromatogram of chemical constituents in LRM

2.3 总花色苷含量测定的方法学考察

2.3.1 线性关系

取标准品溶液，加10%磷酸溶液稀释成质量浓度为0.005、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的标准曲线溶液，按1.3.2.1节方法进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=16 663 335.9X-11 190.0，R=0.999 9。表明矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在0.005～0.08 mg/mL范围内，质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度实验结果

吸取质量浓度为0.04 mg/mL标准品溶液2 μL，连续进样6 次，记录标准品的峰面积，如表3所示，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.20%，说明仪器精密度良好。

表3 精密度结果Table 3 Results of precision test

2.3.3 重复性实验结果

取同一批次样品粉末（HGQ-1）6 份，每份200 mg。按1.3.2.3节方法制备供试品溶液，按1.3.2.1节方法进样。采用外标法，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品，以样品色谱图中各峰的峰面积总值计算总花色苷含量。如表4所示，平均值为2.82%，RSD为1.49%，表明方法重复性良好。

表4 重复性结果Table 4 Results of repeatability test

2.3.4 稳定性实验结果

取供试品溶液，分别于0、2、4、8、20、24、48 h及8 d（192 h）进样，每次2 μL，结果花色苷峰面积总值变化很小，RSD为0.95%，表明供试品在4 ℃、8 d内稳定性良好，结果见表5。同时考察室温下的稳定性，结果显示，室温放置48 h，花色苷峰面积值与初始值相当，8 d后，峰面积值降为初始值的90.4%。

表5 稳定性结果Table 5 Results of stability test

2.3.5 加样回收率实验结果

精密称取黑果枸杞样品粉末适量于100 mL棕色容量瓶中，按表6加入标准品粉末，按1.3.2.3节方法制备黑果枸杞样品并进样，计算回收率，结果见表6。

2.4 样品的花色苷含量测定

精密称取23 批次来源不同的黑果枸杞粉末各200 mg，按1.3.2.3节方法制备供试品溶液，再按1.3.2.1节色谱条件进样并分析，结果见图3、表7。

图3 黑果枸杞样品提取物色谱图Fig.3 UPLC chromatograms of LRM samples extracts

表7 样品中花色苷的含量测定结果Table 7 Contents of anthocyanins in LRM samples determined by UPLC

2.5 不同产地样品对比

对不同产地即青海、新疆和宁夏之间黑果枸杞中总花色苷的含量进行比较，结果如图4所示，并未发现显著性差异（P=0.084）。

图4 不同产地黑果枸杞样品中总花色苷含量的显著性分析Fig.4 Significance analysis of differences in total anthocyanin contents in LRM from different habitats

3 结 论

黑果枸杞中的花色苷类成分具有较高的抗氧化活性[29]。本研究通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术，从黑果枸杞中共鉴定出13 个花色苷，质谱数据信息显示，其中的花色苷类成分大多出现m/z317.06的离子碎片，提示其苷元大多为矮牵牛素，该结果与之前报道的数据吻合[30]。色谱分析结果显示，不同地区的花色苷类成分指纹图谱相似度比较高；本研究可为黑果枸杞的品质评价提供参考，为黑果枸杞的进一步开发利用提供可靠的科学依据。