喉咽清口服液抗炎活性成分的筛选

欧阳文 罗懿钒 ＃唐代凤王雄龙张云坤周华荣于炜民曾颖陈韬刘梓琛胡云舒唐 琴陈 林郭丽娟唐纯玉*李顺祥*

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208； 2.湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心，湖南长沙410208； 3.湖南时代阳光博士后科研流动站协作研发中心，湖南 永州410116； 4.湖南时代阳光药业股份有限公司，湖南 永州410116； 5.湖南省抗感染中药工程技术研究中心，湖南 永州410116； 6.湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410208）

喉咽清口服液来源于民间验方，由土牛膝、马兰草、天名精、车前草4 味药材组成，具有清热解毒、利咽止痛的功效，主要用于肺胃实热所导致的咽部肿痛、发热、口渴、便秘、扁桃体炎、咽炎等症状［1］，为湖南时代阳光药业股份有限公司自主研制开发的国家级新药。孙建辉等［2］采用滴鼻感染甲型H1N1 流感病毒FM1 株建立小鼠流感病毒肺炎模型，发现喉咽清口服液高、中、低剂量组（15.60、7.80、3.90 g／kg）小鼠体质量明显高于模型组，并且高、中剂量组存活时间明显延长，高剂量组肺指数值、死亡率明显降低，在感染第6、9 天高剂量组肺组织病毒载量明显降低，表明该制剂对甲型流感病毒性肺炎具有一定治疗作用。在新型冠状病毒肺炎（COVID⁃19）的治疗过程中，喉咽清口服液（颗粒）于2020 年2 月7 日被湖南省卫生健康委纳入《湖南省儿童新型冠状病毒感染临床诊断与治疗专家共识（试行第一版）》，用于儿童新型冠状病毒感染的防治，适于咽痛偏于风热者［3］。

炎症风暴又称细胞因子风暴，是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子［如肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）、白细胞介素⁃1（IL⁃1）、白细胞介素⁃6（IL⁃6）、环氧化酶⁃2（COX⁃2）、NO 等］ 迅速大量产生的现象，促使免疫系统对人体进行猛烈攻击，引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭［4］。在COVID⁃19、埃博拉病毒、SARS 等传染性疾病中，炎症风暴是轻中症患者向重症或危重症转换的节点，同时也是患者死亡的原因之一，故阻断炎症风暴因子发生、抑制过多免疫细胞活化和细胞因子产生是重要的治疗手段。

临床上利用糖皮质激素（如地塞米松等）可非特异性抑制急性呼吸窘迫综合征炎症反应的特点来治疗COVID⁃19，但其不良反应（如二重感染、糖尿病、骨质疏松、高血压、骨坏死［5］等）较大，长期使用时更明显。当前，以清肺排毒汤等方剂为代表的中药全程参与了相关治疗，可明显改善症状，对于轻症可缩短病程，提高治愈率；对于重症能防止病情进一步发展，促进其恢复，其机制可能不是直接消灭病毒，而是通过抑制活化细胞因子、缓和过激免疫反应、消除炎症来达到作用［6⁃7］。

LPS 刺激小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7 后，可诱导细胞产生多种相关介质和细胞因子（如NO、TNF⁃α、IL⁃6等），从而形成炎症细胞模型，被广泛应用于抗炎药物的筛选和评价。NO 作为炎症介质主要因子之一，在调节多种生理功能方面起到重要作用，如血管扩张、神经传递、炎症应答等，其释放量可用于评价炎症反应的强弱程度［8］。因此，本实验建立LPS 刺激的RAW264.7 炎症模型，通过测定NO 释放量分析喉咽清口服液的抗炎作用，并在此基础上筛选主要活性成分。

1 材料

1.1 药物 喉咽清口服液（批号20171108、20180705、20190716）、成型前喉咽清浸膏（批号20190716）由湖南时代阳光药业股份有限公司提供。

1.2 试剂 小鼠单核巨噬细胞株（RAW264.7）购于中国科学院上海细胞库。竹节参皂苷Ⅳa（PS010730）、竹节参皂苷Ⅴ（PS010731）对照品购于成都普思生物科技股份有限公司，纯度均大于98%。LPS、地塞米松、二甲基亚砜、MTT（美国Sigma 公司）；DMEM 高糖培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，德国Pan Seratech 公司）；PBS 磷酸盐缓冲液（美国HyClone 公司）；NO 检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。ODS⁃AQ（50 μm，日本YMC公司）；色谱纯乙腈、甲醇（德国Merck 公司）；分析纯甲醇（湖南汇虹试剂有限公司）。

1.3 仪器 AL104 电子天平（万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；C18色谱柱（日本YMC 公司）；高效液相色谱仪，配置LC⁃20A 二元高压梯度仪、SPD⁃20A 紫外检测仪（日本岛津公司）；Ulimate 3000／TSQ ENDURA 液质联用仪、二氧化碳培养箱（美国Thermo 公司）；R204B3 型旋转蒸发器（上海申顺科技有限公司）；超净工作台（苏州艾克林净化设备有限公司）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）；低速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；酶标仪（美国BioTek 公司）；数显恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 参照文献［9⁃10］ 报道，将RAW264.7 细胞接种于细胞培养瓶后加到含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，充分吹打混匀，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，在光学显微镜下观察细胞生长状况，每天更换1 次培养基，取对数生长期的细胞进行后续试验。另外，还包括细胞传代、细胞冻存、细胞复苏等基本操作。

2.2 样品制备与单体结构分析 将喉咽清浸膏经ODS⁃AQ反相柱分离后，分别用水、10% 甲醇、30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇、异丙醇进行洗脱，60 ℃下减压浓缩后冷冻干燥，得到相应洗脱部位，精密称取适量，DMSO（终体积不得超过0.1%）完全溶解，完全培养基配制成25、50、100、200、400、800、1 200 μg／mL 稀释液（现配现用），0.22 μm 微孔滤膜除菌，采用LC⁃MS 法进行结构鉴定，并结合对照品比对。LC 分析条件为Weltch Ultimate C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～1.5 min，40%A；1.5～8 min，40%～95% A；8～9.5 min，95% A；9.5～10 min，95%～40% A；10～12 min，40% A）；体积流 量0.2 mL／min；柱温30 ℃；进样量5 μL。MS 分析条件为ESI－离子化模式；喷雾电压3 500 V；鞘气20 Arb；辅助气为10 Arb；离子传输管温度350 ℃；蒸发温度350 ℃；全扫描模式MS SCAN，扫描范围m／z100～1 000。在进行单体抗炎活性实验时，分别精密称取所鉴定成分，DMSO（终体积分数不得超过0.1%）完全溶解，完全培养基配制成3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol／L 稀释液（现配现用），0.22 μm 微孔滤膜除菌。

2.3 细胞毒性检测（MTT 法）称取25 mg MTT 于10 mL离心管中，加5 mL PBS 缓冲液配制成5 mg／mL 溶液，0.22 μm微孔滤膜除菌，4 ℃下避光保存，取生长状态良好、处于对数生长期的培养细胞，脱壁后用含10%灭活胎牛血清的DMEM 培养基配制成单细胞悬液，以3×104个／孔、每孔100 μL 接种于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。设置空白组、对照组、样品组，其中空白组无细胞，对照组加入含100 μL 细胞的DMEM 培养基，样品组加入不同浓度样品（不同溶剂洗脱物、单体成分），使终体积为100 μL（共7 组），每组设3 个复孔，培养24 h。弃去旧培养基，再加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，置于37 ℃CO2培养箱中孵育4 h，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，在培养板平台振荡机上振荡10 min，酶标仪490 nm 波长处测定各孔光密度（OD）值，计算细胞存活率，公式为存活率＝ ［（样品组OD值－空白组OD值）／（对照组OD值－空白组OD值）］ ×100%。

2.4 NO 释放量检测（试剂盒法）取处于对数生长期的培养细胞，脱壁后用含10%灭活胎牛血清的DMEM 培养基制成单细胞悬液，调节细胞浓度为3×104／mL，均匀接种于96 孔培养板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃去原培养液，设置正常组、模型组、样品组，其中正常组不加LPS 和样品；模型组在培养液中加入LPS 溶液（1 μg／mL）；样品组为加入不同溶剂洗脱物、单体成分的100 μL 稀释培养基，每组设置3 个复孔，培养24 h后取上清液于离心管中。按照试剂盒说明书操作方法，将各试剂依次加入培养基中，酶标仪550 nm 波长处测定各孔光密度（OD）值，根据标准曲线检测NO 释放量。

2.5 抗炎活性成分含量测定（RP⁃HPLC 法）

2.5.1 色谱条件 YMC C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃0.5%磷酸（33 ∶67）；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长203 nm。

2.5.2 溶液制备

2.5.2.1 对照品溶液 精密称取竹节参皂苷Ⅳa 对照品3.0 mg，流动相溶解定容于10 mL 量瓶中，过0.45 μm 微孔滤膜，即得（0.3 mg／mL）。

2.5.2.2 供试品溶液 将口服液充分摇匀后精密吸取2 mL，置于10 mL 量瓶中，“2.5.1”项下流动相超声定容，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.5.3 方法学考察

2.5.3.1 线性关系考察 精密吸取竹节参皂苷Ⅳa 对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归。

2.5.3.2 精密度试验 精密吸取竹节参皂苷Ⅳa 对照品溶液5 μL，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定6 次，计算峰面积。

2.5.3.3 重复性试验 取同一份口服液（批号20190716）6 份，按“2.5.2.2”项下方 法制备 供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定6 次，计算峰面积。

2.5.3.4 稳定性试验 取同一份口服液（批号为20180705），按“2.5.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，计算峰面积。

2.5.3.5 加样回收率试验 精密吸取各成分含量已知的口服液0.5 mL，加入等量对照品溶液，流动相定容于5 mL量瓶中，微孔滤膜过滤，在“2.5.1”项色谱条件下进样20 μL 测定，计算回收率。

2.6 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 LPS 质量浓度筛选 表1 显示，不同质量浓度LPS 对RAW264.7 细胞分泌的NO 均具有促进作用，并呈剂量依赖性；作用24 h 后，0.01～1 μg／mL LPS 对细胞无明显毒性，而在10 μg／mL 下细胞 存活率下降（P＜0.05），100 μg／mL下更明显（P＜0.01）。为了能最大限度刺激RAW264.7 细胞释放NO，并不影响其存活率，本实验采用1 μg／mL LPS 质量浓度。

表1 不同LPS 质量浓度下的NO 释放量和细胞存活率（， n＝3）

表1 不同LPS 质量浓度下的NO 释放量和细胞存活率（， n＝3）

注：与空白组（0 μg／mL）比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 洗脱部位质量浓度筛选 表2 显示，洗脱部位质量浓度为400～1 200 μg／mL 时各部位细胞均有不同程度的死亡，低于200 μg／mL 时细胞存活率较高，即无明显细胞毒性。因此，本实验选择6.25、12.5、25、50、100、200 μg／mL进行下一步研究。

表2 不同洗脱部位质量浓度下的细胞存活率（， n＝3）

表2 不同洗脱部位质量浓度下的细胞存活率（， n＝3）

注：与空白组（0 μg／mL）比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 各洗脱部位对NO 释放量的影响 表3 显示，与模型组比较，各洗脱部位组均呈剂量依赖性地降低NO 释放量，以70%甲醇部位体外抑制作用最强，IC50为35.25 μg／mL，是最佳活性部位。

表3 各洗脱部位对NO 释放量的影响（， n＝3）

表3 各洗脱部位对NO 释放量的影响（， n＝3）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 成分分析与鉴定 图1 显示，70%甲醇洗脱部位中有2 个主要色谱峰经液质联用色谱分析，峰1、2 在总离子图中的保留时间分别为2.80、4.58 min，准分子离子峰［M⁃H］－m／z分别为955.38、793.30。结合对照品比对，鉴定两者分别为竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa。

图1 70%甲醇洗脱部位RP⁃HPLC 色谱图

3.5 各成分活性研究 地塞米松为常用激素类抗炎药物，故本实验选择其作为阳性对照，分析竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa 的体外细胞毒性和抗炎活性，结果见表4～5。由表4 可知，各成分浓度在3.13～50 μmol／L 时均对细胞无明显毒性，而在100～200 μmol／L 时细胞均有不同程度地死亡，故选择3.13、6.25、12.5、25、50 μmol／L 作为检测浓度。由表5 可知，与模型组比较各成分浓度在3.13～50 μmol／L时均可呈剂量依赖性抑制NO 释放，以地塞米松作用最强；相对竹节参皂苷Ⅴ，竹节参皂苷Ⅳa 活性更强。

表4 各成分细胞存活率（， n＝3）

表4 各成分细胞存活率（， n＝3）

注：与空白组（0 μg／mL）比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表5 各成分对NO 释放量的影响（， n＝3）

表5 各成分对NO 释放量的影响（， n＝3）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

3.6 方法学考察 竹节参皂苷Ⅳa 与相邻峰可基线分离（分离度大于1.5），在相同保留时间内空白无干扰（图2）；该成分回归方程为Y＝359 972X－20 210（R2＝0.999 6），在0.15～3.0 μg 范围内线性良好（R2＝0.999 6）；精密度、重复性、稳定性试验中，该成分峰面积RSD 分别为1.15%、1.48%、1.09%，表明仪器精密度、方法稳定性理想，溶液在24 h 内稳定性良好。加样回收率试验结果见表6。

表6 竹节参皂苷Ⅳa 加样回收率试验结果（n＝6）

图2 竹节参皂苷Ⅳa RP⁃HPLC 色谱图

3.7 样品含量测定 取3 批口服液，按“2.5.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表7，可知均超过了0.2 mg／mL。

表7 竹节参皂苷Ⅳa 含量测定结果

4 讨论

喉咽清口服液临床疗效显著，市场销售良好，前期已证实该制剂对甲型流感病毒性肺炎具有治疗作用［2］，而本实验进一步考察该制剂总浸膏和单体成分的抗炎活性。先采用1 μg／mL LPS 建立RAW264.7 炎症细胞模型，发现模型组NO 释放量明显高于正常组，表明造模成功，再经ODS⁃AQ 反相柱分离总浸膏，用不同溶剂进行洗脱，结果显示各洗脱组分均可剂量依赖性地降低NO 释放量，以70%甲醇组分作用最强。

在2015 年版《中国药典》 喉咽清口服液的质量标准中，样品水解后石油醚萃取，薄层层析分离，再通过薄层色谱扫描法测定水解产物中齐墩果酸含量［11］，但其准确性、稳定性、精密度都不理想，并且通过水解方式所得到的该成分是多种皂苷的苷元，而不是单一成分，故无法全面控制该制剂质量。本实验采用LC⁃MS 定性鉴定结合RP⁃HPLC 定量分析，发现主要活性成分为竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅳa，以后者含量更高，活性更好。另外，RP⁃HPLC法具有样品处理简便，线性关系、重复性、仪器精密性良好的优点，经该方法测得竹节参皂苷Ⅳa 平均含量大于0.2 mg／mL，表明可通过分析该成分来控制喉咽清口服液的质量。