电雾式检测器在中药分析中的应用

袁明昊，魏蔼玲，刘红梅，刘雨诗，叶 强，郭 力

（成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137）

液相色谱自1903 年发明至今取得了令人瞩目的进展，HPLC 法是最广泛的分析手段之一。随着HPLC 应用的持续增加，对其性能及与之搭配的检测器的需求也越来越高［1］。目前紫外检测器（Ultraviolet detector，UV）是HPLC使用最广泛的检测器，但当被测物缺乏强生色团时，紫外检测器便 不适用［2］。电雾式 检测器（Charged aerosol detector，CAD）是ESA 公司于2004 年10 月推出的具有专利技术的一种新型HPLC 检测器［3］，其响应值不依赖于被测物质的光学性质和离子化效率，能检测全部非挥发性和很多半挥发性物质，可替代紫外检测器检测非紫外或弱紫外活性的化合物［4］，目前已广泛应用于药物的含量测定、杂质控制和辅料评价等相关领域［2］。

中药在我国具有数千年的历史，是中华民族的文化瑰宝，对中华民族的繁衍生息做出了重大的贡献，如今对于中药的研究不仅局限于疾病的防治，其药效物质基础与质量控制等问题亦成为研究的重点，但由于中药化学成分的复杂性使中药成分分析一直存在分离难度大，分析时间长等问题［5］。近年来CAD 作为一种新型通用型检测器在中药分析领域中表现出广泛的适用性，尤其适用于皂苷、糖类和生物碱类等无紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析与检测［6］。本文概述了CAD 的原理及其在中药成分分析中的应用进展。

1 CAD 简介

1.1 CAD 检测器原理 CAD 检测器是一种通用型检测器，其响应依赖于分析物的初始质量浓度而与分析物的化学性质无关。首先，雾化器雾化样品溶液撞击碰撞挡板形成溶质颗粒，较小的溶质颗粒经干燥管干燥后在碰撞室中与带正电的氮气粒子碰撞产生电荷转移，随后带电荷的溶质颗粒将其电荷转移至收集器，通过静电检测器检测溶质带电量由此产生信号电流［6］。

1.2 CAD 与HPLC 常用检测器性能对比 检测器是HPLC系统的重要组成部分，充当着“眼睛”的角色，面对中药中复杂的化学成分，选择恰当的检测器尤为重要。HPLC法常用的检测器有UV、示差折光检测器（Refractive index detector，RID）、荧光检测器（Fluorescence detector，FLD）、质谱检测器（Mass spectrometry，MSD）、蒸发光散射检测器（Evaporative light⁃scattering detector，ELSD）和电雾式检测器（CAD）等［7］。其中UV 适用于测定含有紫外生色团的化合物［8］；RID 在灵敏度上具有局限性，且无法进行梯度洗脱［9］；FLD 应用范围较窄，适用于检测能激发荧光的化合物或衍生后能激发荧光的化合物；MSD 的仪器使用成本较高，且仪器对实验人员要求较高，不利于广泛的应用及推广［10］；ELSD 与CAD 二者都是基于雾化－气溶胶原理的HPLC 检测器，通过雾化蒸发液相色谱流动相后对目标化合物进行检测，均可用于检测无紫外吸收或吸收较弱的化合物。两者区别在于CAD 是基于带电粒子的电信号，而ELSD 则是基于目标化合物的散射光信号［11］，且相对于ELSD 而言，CAD 的灵敏度更高，对同一化合物的检出限平均比ELSD 低一个数量级［12］；CAD 生成的信号受雾滴大小或雾滴大小分布情况的影响较小［13］；每台电雾式检测器在出厂前已固定好了一个最佳条件无法改变，且受环境影响很小，故CAD 的重现性更好；CAD 的检测范围更宽，可从μg⁃pg 跨越4 个数量级；CAD 的维修费用更低，ELSD 需将样品全部雾化进行检测，而CAD 只有少部分样品进入干燥管进行后续检测，因此CAD 仪器内部的污染几率较ELSD更低且电晕电极的使用寿命也明显高于氘灯［1］；在梯度洗脱条件下，CAD 比ELSD 更敏感［14］。与其他检测器比较，CAD 具有的一大优点是设置参数少（只需调节内部压力），平衡时间短，安装、操作简单，为实验操作人员带来了方便［1］。各种HPLC 分析常用检测器的性能比较见表1。

表1 HPLC 常用检测器的主要性能一览表

2 CAD 在中药成分分析中的应用

2.1 分析糖类化合物 小分子的脂溶性成分一直是中药药效物质基础的研究重点，但近年来中药及其制剂中的单糖、寡糖以及多糖越来越多的成为药效物质基础研究的重要对象。糖类具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等多种生物活性［15］，目前UV、二极管阵列检测器（Diode array detector，DAD）和FLD 检测器用于糖类物质的检测均需柱前衍生化，过程繁琐。ELSD 和RID 虽不需衍生化，但RID 的灵敏度较低，无法进行梯度洗脱，且易受温度和流动相的影响，在进行多组分分析时效果不佳。ELSD 的灵敏度较高且可进行梯度洗脱，但由于其结构的特点，在耐用性与稳定性方面存在不足［16⁃17］。CAD 是一种通用型质量检测器，其应用于糖类检测在灵敏度、稳定性等方面优于其他检测器，尤其在分析测定单糖和二糖等低聚糖具有较好的效果［16］。张素红等［16］首次建立了使用HPLC⁃CAD 法同时测定白茅根样品中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。结果3 种糖类成分分离完全，方法学考察各项内容均符合含量测定要求。张雪等［17］建立了30 min 内同时测定白及中果糖、甘露糖、葡萄糖和蔗糖含量的HPLC⁃CAD 方法，其测定结果较蒽酮⁃硫酸比色法的特异性与准确性均具有明显的提高。Li 等［18］利用微波辅助提取法和HPLC⁃CAD 法同步测定了菊科、桔梗科和茜草科12 种植物中11 种菊粉型低聚果糖（FOS）（DP3⁃DP13）的含量，这也是首次报道不同种属植物中FOS 的含量对比，将有助于中药资源的质量评价。此外，CAD 在黄芪［19］、人参［20］等多种植物的糖类分析中，均取得令人满意的结果。

2.2 分析皂苷类化合物 皂苷类化合物主要分布于陆地高等植物中，如人参Panax ginsengC.A.Mey.、柴 胡Bupleurum chinensie DC.、三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 等，具有抗肿瘤、抗菌、解热、镇静、抗抑郁等生物活性［21］。皂苷类化合物通常无紫外吸收或仅为末端吸收，UV 对于这类化合物的检测不稳定，并且在梯度洗脱时容易出现基线漂移。ELSD 对皂苷的检测灵敏度高于UV 的末端波长检测，但对低含量成分的检测重复性差［22］，而CAD 检测器能较好的解决这些问题。黄芪甲苷在使用UV对其进行检测时需将样品进行衍生化处理，但衍生化过程复杂且测定样品所需时间较长，目前多采用ELSD 进行检测。刘兴国等［23］比较了HPLC⁃CAD 与HPLC⁃ELSD 法应用于黄芪甲苷含量测定的优劣，结果表明CAD 和ELSD 的方法学精密度和对数线性关系均良好，但CAD 的测定检出限和定量限比ELSD 低1 个数量级且CAD 的色谱峰对称性要好于ELSD。此外，廖强等［24⁃25］也使用CAD 检测器分别对黄芪及其复方中黄芪甲苷的含量进行测定，均取得较好的检测效果。王丽娜等［26］利用HPLC⁃CAD 法同时测定了13批不同产地柴胡药材中柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d 的含量，结果基线平稳、干扰小、峰形对称、分离度好、准确度高，明显优于高效液相色谱⁃紫外检测法。Wang等［27］建立了同时测定人参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 含量的LC⁃CAD 法，并与ELSD 和UV 检测器进行了对比，结果表明CAD 对人参皂苷的定量限和检测限最低，线性稍好于ELSD，比ELSD 具有更好的重现性，接近于UV 的重现性。目前CAD 的应用以在皂苷类成分分析中应用最多［6］，表明CAD 在皂苷类成分分析方面的效果尤为突出［28］。

2.3 分析生物碱类化合物 生物碱是主要存在于植物体内的一类含氮的碱性有机化合物，大多具有较复杂的环状结构，近年研究表明其具有抗肿瘤、抗菌消炎、镇痛等生物活性［29］。部分季铵型生物碱、异甾体生物碱等无共轭结构，使用紫外检测器无法得到满意的检测结果。张敏利等［30］采用CAD 检测器直接测定了枸杞子中甜菜碱的含量，大大简化了分析操作步骤，避免了以往紫外检测法用于甜菜碱测定的柱前衍生化过程，且得到了比较精确的结果。廖强等［31］通过柱后补偿液相色谱结合CAD 检测器测定了浙贝母中贝母素甲和贝母素乙含量，与药典方法进行比较，提高了重现性及响应因子的一致性，可在缺少对照品的情况下，作为贝母素甲和贝母素乙的相对测定方法。高攀等［32］使用HPLC⁃CAD 法同时测定了元胡止痛胶囊中4 种生物碱类成分延胡索乙素、盐酸黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索甲素的含量，结果准确，为中药复方的多成分质量控制提供了更全面的方法。

2.4 分析萜类化合物 萜类化合物是自然界广泛存在的一大类异戊二烯衍生物，具有抗癌、消炎、降糖等药理作用，被广泛应用于医疗、食品及日化等领域［33］。银杏叶萜类内酯因其在银杏叶中的含量很低，且紫外吸收较弱，一般的分析方法很难测定［34］。刘丽娜等［35］使用HPLC⁃CAD 法测定了银杏叶提取物中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C 4 个萜类内酯的含量，将该法检测结果与《中国药典》 采用的HPLC⁃ELSD 法进行对比，CAD 检测器对这4 种萜类内脂的灵敏度和响应一致性均优于ELSD 检测器。白钢钢等［34］建立了4 种银杏叶制剂中萜类内酯类成分的含量测定的方法，该法重复性良好，操作简单，具有高准确度与灵敏度，可用于银杏叶制剂中萜类内酯类成分的含量测定。齐墩果酸和熊果酸在紫外区只有末端吸收，响应值较低且存在背景干扰，不易采用紫外检测器进行定量分析［36］。燕霞等［37］建立了一种基于HPLC⁃CAD 测定女贞子药材中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，方法学考察各项内容均符合要求，结果准确。Zhang 等［38］建立了HPLC⁃CAD 法测定川楝子中川楝素含量的方法，并对ELSD 与CAD 的灵敏度进行了评估和比较，结果表明CAD 法得到的川楝素的检测限和定量限分别比ELSD 法低30 和25 倍。

2.5 分析甾体类化合物 目前，使用RP⁃HPLC 法可以实现对部分胆汁酸的定性和定量分析。但由于胆汁酸是一类紫外吸收较弱的固醇类化合物，使用UV 检测灵敏度很低，目前大多采用ELSD 检测。王一博等［39］使用HPLC⁃CAD 法同时测定了熊、猪、牛、羊胆粉中5 种胆汁酸的含量，并将本方法与HPLC⁃ELSD 法相比较，结果CAD 的灵敏度为ELSD 的3 倍，线性范围比ELSD 高2 个数量级，并且CAD的响应因子比ELSD 更具有一致性。马婷婷等［40］建立了HPLC⁃CAD 法测定蛇胆汁中牛磺胆酸钠的含量，与UV、ELSD 进行比较，CAD 法得到的牛黄胆酸钠的LOD、LOQ分别比ELSD 低46、40 倍，比UV 低134、116 倍。表明CAD 检测器在甾体化合物中的测定具有明显的优势。

2.6 分析脂肪酸类化合物 GC 和HPLC 与不同的检测器联用是目前常用的检测脂肪酸的方法，气相色谱⁃氢焰离子化检测器（Gas chromatography⁃flame ionization detector，GC⁃FID）分析脂肪酸具有准确度高、灵敏度高和操作方便等优点，GC⁃MS 结合了GC 的高分辨率和MS 的高灵敏度，并具有较高的定性和定量潜力。但在GC⁃FID 和GC⁃MS 测定前，均需进行脂肪酸衍生化以增加其挥发性并降低其极性，该法繁琐而费时。采用HPLC⁃CAD 方法，可直接分析脂肪酸而无需衍生化反应，因此，HPLC⁃CAD 被认为是脂肪酸分析中最有效、最通用的技术之一。Yang 等［41］通过响应面法优化了藿香籽油的提取工艺，并建立了快速、非衍生化的HPLC ⁃CAD 方法用于同时测定藿香籽油中五种脂肪酸的含量。Wu 等［42］研究并开发了一种高效提取鸦胆子油的方法，并建立了HPLC⁃CAD 法分析了14 批不同产地的鸦胆子中5 种脂肪酸的含量，该法避免了样品预处理的复杂性，灵敏度高、检出限低，同时，CAD 检测器的使用还检出了之前从未在鸦胆子油中检出的亚麻酸。

2.7 分析其他类化合物 赵鑫等［43］采用HPLC⁃MS⁃CAD 色谱联用技术，对辛夷中松脂素二甲醚、木兰脂素、里立脂素B 二甲醚和表木兰脂素A 4 个指标性成分进行了定量分析，成功建立了基于CAD 检测特点的辛夷药材提取物质量控制的一测多评新方法。Wong 等［44］通过UHPLC 法与电雾式检测器（UHPLC⁃CAD）相结合测定了银黄滴丸中赋形剂聚乙二醇PEG⁃4000 的含量。罗昌明等［45］运用HPLC⁃CAD法同时测定了风湿定片中八角枫苷A、甘草酸、水杨苷、甘草次酸、毒藜碱、丹皮酚、欧前胡素及异欧前胡素的含量，其中八角枫苷A、水杨苷、甘草次酸、异欧前胡素均为首次测定，该法操作简便、准确度高，有效地实现了风湿片的多成分质量控制。Zhang 等［46］首次采用HPLC⁃CAD法测定了补骨脂中13 种组分的含量，结果表明CAD 对其中大多数化合物检测的灵敏度是DAD 的二倍。更多CAD在中药成分分析中的应用见表2。

表2 CAD 在中药成分分析中的应用

2.8 局限与发展趋势 CAD 在中药领域的应用越来越广，而实验过程中的一些问题也随即暴露，如待测物需先经干燥，故难以检测挥发性物质；该监测器基于气溶胶方法获得的浓度和峰面积均为非线性的，在实际计算中不如紫外检测器方便［64］且不能像质谱探测器那样识别某个峰或进行峰纯度分析［9］；此外其响应会受流动相组成的影响，但该问题可以通过逆浓度梯度补偿法来解决，即在色谱柱后进入检测器前加入另一分析溶剂，通过增加有机相比例，可以提高雾化效率，增加响应值，降低检出限，提高检测效果［4］。虽然CAD 检测器具有一定的局限性，但不失为紫外检测器等其他检测器的有力补充，尤其是随着多维色谱技术的联合应用，多种检测器的联用也越来越普及，UV 与CAD 检测器的联用可以实现大部分无紫外吸收化合物与有紫外吸收化合物的同时检测，并能对其准确定量。此外，如今大力提倡绿色化学，乙腈作为液相色谱分析中最常用的溶剂在分离和检测方面具有很好的物理化学性质，但从其毒性角度来看并不符合绿色化学标准。丙酮被称为仅次于水的第二绿色溶剂，有文献表明可在反相液相色谱⁃电雾式检测器中用丙酮作为乙腈的替代品，且丙酮的相对高挥发性也符合CAD 对流动相的要求，但丙酮的紫外截止波长为330 nm，并不适用于紫外检测器［2，65］。由此可见CAD 的局限并不会成为阻碍其发展的原因，相反随着色谱技术的发展，CAD 能更好的适用于中药分析领域研究中。

3 展望

中药是中华民族智慧的结晶，要实现中药现代化、国际化，一套被国际认可的质量控制标准是必不可少的，但中药成分的复杂性使中药成分分析一直存在诸多困难，需要一种高效率、高灵敏度、高重现性的分析手段来解决这些困难。近年来，CAD 检测器的应用为中药分析方法提供了更多的选择，在中药物质基础与质量控制方面发挥着重要的作用，但总体来看，CAD 检测器在中药领域的应用并不广泛，主要集中于糖类和皂苷类化合物的检测，而对于生物碱、萜类等化合物的报道较少。且CAD 检测器也存在一些缺陷，如其浓度和峰面积均为非线性的，在实际计算中可能不如紫外检测器方便等。其次，使用UV 检测器可解决绝大多数中药化学成分的分析问题，且几乎所有液相色谱都配有UV 检测器，CAD 则更多作为UV 检测器的补充。尽管如此，CAD 仍不失为一款良好的通用型检测器，未来该检测器可应用于更多种中药成分的分析以及多组分的含量测定，同时也适用于指纹图谱的建立以及提取工艺优化等方面。同时随着中药剂型的增多，CAD 检测器在中药制剂的杂质检查与辅料评价方面也具有很大的发展潜力。CAD 检测器在中药领域新的应用还需要进行更深入研究，不断的扩展，并通过改进方法规避其局限性，使中药分析方法更加绿色科学，中药有效成分更加明确，中药质量控制更加规范。