无乳链球菌临床株对四环素类的敏感性研究

赵琳珊，徐广健，陈俊文，孙翔，邓启文，余治健，李多云

深圳大学医学院附属南山医院感染科及内源性感染诊治研究重点实验室，广东 深圳 518052

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，S.agalactiae)又称B族链球菌(group BStreptococcus，GBS)，是一种革兰阳性球菌，属乙型溶血性链球菌，是引起新生儿脓毒血症和脑膜炎的主要病原体；它也是定植在女性生殖道和消化道的条件致病菌，是导致孕妇感染性疾病和不良妊娠结局的重要危险因素[1-4]。近年来，全球新生儿侵袭性GBS感染的发病率为0.49‰，非洲最高(1.12‰)，亚洲最低(0.30‰)。导致亚洲地区GBS感染患病率明显偏低的潜在因素可能包括其在孕产妇中的总体定植率低、病例统计不完全以及缺乏训练有素的临床医师和适当的实验室设施来识别这种疾病，特别是在基层卫生中心[1]。治疗GBS感染的首选药物是青霉素，但其对抗生素的耐药率正逐年上升，这与畜牧业及人群中长期滥用抗生素有直接关系。GBS对青霉素的敏感性也呈下降趋势[5-6]，但总体仍是敏感的。对于青霉素过敏或治疗失败的病例，须寻找替代方法，包括大环内酯类和四环素类。有研究报道，GBS对四环素类的耐药机制包括外排泵、核糖体保护和四环素类的酶促失活，而链球菌四环素类耐药基因主要有核糖体保护基因(包括tetM和tetO)和外排泵编码基因tetK[7]。

随着多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)的应用，某些ST型GBS具有更高的侵袭性，而其他型则主要是定植菌株，且不同ST型GBS对抗生素的敏感性不同[8]。Manning等[9]发现，ST17和ST19型是导致加拿大新生儿侵袭性感染的主要基因型，而ST1、ST12和ST23型是孕妇感染的主要基因型。在我国，ST17型也是GBS感染新生儿的主要基因型，ST19型是感染孕妇的主要基因型[10]。

以往研究分析GBS对大环内酯类的敏感性较多，分析其对四环素类的敏感性较少。因此，本研究收集来自深圳市南山区人民医院的136株GBS临床分离株，探讨其对四环素类敏感性及耐药机制，分析不同ST型GBS的流行情况，以及四环素类敏感性与ST型之间的关系，期望为GBS感染的临床诊治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

收集深圳市南山区人民医院2014—2017年分离自患者血液、尿液、脑脊液、羊水等标本的GBS。质控菌株为肺炎链球菌ATCC 49619菌株(由本实验室长期保存)。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验采用Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统(美国BD公司)进行四环素类药敏试验，参照2016年版美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南[3]，使用琼脂稀释法再次确认四环素类耐药标准，并以肺炎链球菌ATCC 49619作为质控菌株。四环素类敏感、中介和耐药的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)折点分别为MIC≤2 mg/L、MIC=4 mg/L和MIC≥8 mg/L。

1.2.2 四环素类耐药基因扩增参照Dutra等[11]的方法，由华大基因公司合成四环素类耐药基因tetM、tetO和tetK引物。按DNA提取试剂盒 (Invitrogen)说明书提取菌株基因组DNA，采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增四环素类耐药基因，琼脂糖凝胶电泳分析tetM、tetO和tetK扩增条带并测序。

1.2.3 GBS的MLST分型参照文献[5,12]的方法，设计管家基因引物，由华大基因公司合成。按DNA提取试剂盒说明书提取菌株基因组DNA，采用PCR扩增MLST管家基因，扩增产物送华大基因公司测序后进行标准序列比对。参考GBS MLST数据库(http://pubmlst.org/sagalactiae)，应用软件DNAMAN.full.version.V5.2.2对各管家基因序列及型别进行对比分析以确定MLST分型。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 5.0软件作图，采用卡方检验及非参数检验比较组间差异。所有统计学分析由SPSS 19.0软件进行，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 GBS的标本来源特点

本研究收集深圳市南山区人民医院GBS临床分离株共136株，分别来自尿液(31%)、血液(19%)、脓液(19%)、羊水(8%)、宫颈分泌物(8%)、胃液(3%)、脑脊液(3%)和其他(10%)。根据年龄将患者分为<1岁组(婴儿组)、19～44岁组(青年组)、45～65岁组(中年组)及>65岁组(老年组)，本研究中无2～18岁人群。4组患者的年龄、性别、标本来源等情况如表1所示。其中19～44岁女性所占比例最高(25%)，且该组男女比例为1∶2.8；其余3组男女比例均为1∶1，提示中青年女性是GBS感染的主要人群。在 GBS血流感染患者中，<1岁组有13例(50%)，所占比例最高，其次为>65岁组8例(30.8%)，其余两组分别为4例(15.4%)、1例(3.8%)，提示免疫力低下人群易发生GBS血流感染。值得注意的是，在收集的脑脊液样本中仅在<1岁婴幼儿组中培养到GBS。

表1 136株无乳链球菌的标本来源

2.2 GBS对四环素类的耐药性及其与四环素类耐药基因的关系

根据2016年版美国CLSI指南[3]推荐方法，检测136株GBS的四环素类MIC值，其中敏感73株、中介0株、耐药63株，耐药率为46.32%；进一步检测四环素类耐药基因tetM、tetO和tetK，其中tetM+菌株64株(47.1%)、tetO+菌株43株(31.6%)、tetK+菌株38株(27.9%)、tetM+tetO+菌株7株(5.1%)、tetK+tetO+菌株1株(0.7%)，未检测到tetM+tetK+菌株(见表2)。分析 MIC值，tetO+菌株的MIC50/MIC90明显高于其他组；各组耐药基因阳性菌株与阴性菌株之间耐药率无显著性差异，但MIC值均有显著性差异(P<0.05)，其中tetM+菌株秩均值高于tetM-菌株，提示tetM为GBS对四环素类的耐药位点。tetM+tetO+菌株及tetK+tetO+菌株较少，故未进行统计学分析。

表2 携带不同耐药基因无乳链球菌的四环素类MIC值(n=136)

2.3 GBS的MLST分型及其与四环素类耐药之间的关系

对136株GBS临床分离株进行MLST分型，前5位分别是ST17(25株，18.4%)、ST19(25株，18.4%)、ST10(21株，15.4%)、ST12(13株，9.6%)和ST23(11株，8%)。GBS对四环素类的耐药情况及其与主要ST型之间的关系如表3所示，其中ST12型和ST17型GBS对四环素类的耐药率(61.5%和60.0%) 明显高于其他组，ST10型GBS对四环素类的耐药率最低(28.6%)。比较各ST型GBS之间四环素类MIC值的差异，结果显示ST12型GBS与其他型别GBS之间无显著性差异(P>0.05)。菌株数数据提示ST17型和ST19型是GBS主要流行型别，且ST17型对四环素类的耐药率高于ST19型(χ2=3.945，P=0.047)。

表3 无乳链球菌的四环素类MIC值与MLST分型之间的关系(n=136)

3 讨论

GBS是健康女性胃肠道和生殖道中的常见菌群，但可通过产道引起新生儿败血症及脑膜炎[13]，其感染也是导致老年人和免疫功能低下成年人死亡的重要原因[14]。成年人感染GBS主要引起菌血症、皮肤和软组织感染、肺炎、骨髓炎和尿路感染。本研究分析了136株GBS临床分离株的标本来源，结果提示中青年女性是携带GBS的主要人群，老年人、婴幼儿等免疫力低下人群易发生GBS感染所致脓毒血症，且仅在婴幼儿脑脊液中培养出了GBS，与以往研究结果相符[1-3]。尽管深圳市的产前筛查覆盖率很高，但GBS感染仍是导致3个月以下婴儿细菌性脑膜炎的主要原因之一，因此迫切需要更好的措施来预防新生儿GBS感染。

GBS分离菌株的药敏试验对选择合适的抗生素治疗至关重要。本研究结果显示，GBS对四环素类的耐药率为46.32%，显著低于非洲国家(82.6%)[15]及一项中国多地区(68.9%)[16]研究中的结果，但与埃塞俄比亚一项有关肠道和阴道定植菌对四环素类的耐药率研究结果(45.2%)[17]相似。可能的原因是前两项研究中主要标本来源为侵袭性感染，而本研究中菌株主要来自非侵袭性感染。本研究还检测了四环素类耐药基因tetM、tetO和tetK，并分析其与四环素类耐药的关系。结果显示，tetM基因携带率最高，四环素类对tetM+菌株具有更高的MIC值，提示tetM是GBS对四环素类耐药的主要耐药基因；tetO+菌株的MIC50/MIC90高于其他组，但相较于tetO-菌株，四环素类对tetO+菌株并未表现出更高的MIC值。有趣的是，本研究还观察到少量四环素类敏感GBS菌株也携带耐药基因，提示携带耐药基因的菌株并不都表现出耐药，它们可能含有特定的沉默机制，有待进一步研究。tetM是核糖体保护基因，表明GBS耐药主要是通过核糖体保护机制。四环素类核糖体保护蛋白是与延伸因子EF-G和EF-Tu具有显著序列和结构相似性的鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)酶，而最常见的核糖体保护基因是tetO和tetM，彼此具有75%的序列相似性[8]。有研究证实，tetM基因是对四环素类耐药的革兰阳性细菌(包括GBS)中最普遍的耐药基因[18]，本研究结果也表明tetM+菌株对四环素类的敏感性显著低于tetM-菌株。

MLST分型对流行病学研究及疫苗研制均有重要意义。本研究检测了136株GBS的MLST分型，前5位分别是ST17、ST19、ST10、ST12和ST23，与Nie[16]等对中国广东地区GBS的MLST分型结果相似，但与Kernéis等[18]对法国地区关节GBS的MLST分型结果明显不同，提示MLST分型在不同国家、不同地区间存在差异。多项研究[6,8]证实，ST17型及ST19型菌株是耐四环素类GBS的主要流行型别，本研究结果也证实ST17型及ST19型GBS是深圳市南山区人民医院患者中耐四环素类GBS的主要流行型别，且ST17型对四环素类的耐药率高于ST19型。以上结果提示在我国ST17型GBS是对四环素高耐药的流行菌株，可作为预防耐四环素类GBS感染的疫苗研究候选菌株，对其所致感染性疾病的监测也可为疾病控制提供依据。本研究结果还显示，ST12型和ST17型GBS有更高的MIC50/MIC90，但两者之间无统计学差异，这可能是由于样本数量少，可进一步扩大样本量来加以验证。疫苗接种可预防感染发生，故其可能成为围产期抗生素预防感染的良好替代方案[8]，但目前尚无预防GBS感染的疫苗，这与MLST分型的地域多样性和随时间变化产生的多变性有关。因此，开发可全球应用的GBS疫苗是一项挑战，依据各地区不同流行病学特点制备相应的疫苗是可能的解决方案。

本研究存在以下不足：首先，样本量小，如要得出更加确切详尽的结果，需要多中心、长时间的随访研究；其次，仅研究了GBS对四环素类的敏感性，未研究其对新型四环素类抗生素及其他类抗生素的敏感性，这些有待进一步探讨。