广西人类免疫缺陷病毒感染者/艾滋病患者合并马尔尼菲篮状菌感染的特征及Mp1p抗原快速筛检的研究

韩静，蒋忠胜，王刚，张鹏，胡家光，韦吴迪，张洪，何锦豪，李玥琪，宁传艺，梁浩

1. 广西医科大学生命科学研究院，广西壮族自治区 南宁 530021； 2. 广西艾滋病防治研究重点实验室，广西壮族自治区 南宁 530021； 3. 柳州市人民医院，广西壮族自治区 柳州 545006； 4. 广西医科大学护理学院，广西壮族自治区 南宁 530021； 5. 广西生物医药协同创新中心，广西壮族自治区 南宁 530021； 6. 广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区 南宁 530021

马尔尼菲篮状菌病(talaromycosis)是由马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei，TM)引起的一种机会性、地域性流行真菌病，主要流行于亚洲热带地区，尤其是泰国、越南，以及中国的广西壮族自治区、广东省、中国香港和中国台湾等地区。TM主要感染免疫力低下人群，如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者。其起病隐匿，易漏诊、误诊，病原学培养确诊耗时长，而病情进展迅速且严重，是导致HIV感染者/ AIDS患者死亡的主要原因[1]。广西HIV感染人口居我国第二，是HIV流行重灾区，马尔尼菲篮状菌病也继肺结核成为第二大机会性感染引发的疾病，致死率第一[2]。

Mp1p是一种分泌型甘露糖蛋白, 是TM特异的有免疫原性的表面蛋白，也是其重要的毒力因子[3]，与其双相发育有密切关系[4-5]。血培养等病原学方法确诊TM感染耗时长，灵敏度不高(76%)[6-7]，难以做到早发现、早治疗。近年来，对Mp1p的研究逐步深入，发现其可作为TM感染早期诊断的靶标[8]。目前已开发出通过酶联免疫法等检测血样中的Mp1p抗原或抗体而快速辅助诊断临床TM感染的试剂盒，但尚未得到较好的应用评价。本研究收集广西壮族自治区柳州市人民医院诊治的HIV感染者/AIDS患者合并TM感染的临床信息，对TM感染的流行病学信息进行分析，并检测收集的血浆样本以评估目前应用的TM抗原试剂盒(酶联免疫法)，为临床早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源

以问卷调查(均取得患者知情同意)的方式收集广西壮族自治区柳州市人民医院感染科于2018年8月—2019年6月确诊的HIV感染者/AIDS患者基本信息(包括一般基本信息、临床表现及用药情况、TM感染相关因素、抗病毒治疗等)，并采集其血浆和咽拭子样本，通过查阅电子病历系统收集患者的实验室检查指标(包括血常规、肝功能及CD4+T细胞计数等)及数据。纳入患者年龄18～60岁，排除既往合并TM感染和已接受抗真菌药物治疗及有重大慢性疾病(心、肾、内分泌、代谢或自身免疫性疾病)者，共200份样本符合要求，其中合并TM感染者20例(1例合并结核分枝杆菌感染)，合并其他机会性病原感染者29例。

1.2 诊断标准

AIDS的诊断符合《艾滋病诊疗指南(2018版)》标准[9]。200例患者均经过初筛和确证试验，初筛采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，测出血清HIV抗体阳性，然后经蛋白质印迹法确证为HIV感染。对所有符合纳入标准的患者进行TM血培养，血培养阳性即诊断为TM感染。如血培养阴性，则根据AIDS合并TM临床诊断评分体系[10]进行判断：①CD4+T细胞计数≤25/μL；②门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)>1×正常上限值(upper limits of normal，ULN)且AST/丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)>1；③肝、脾大；④外周或腹腔淋巴结肿大。对符合以上任一项的可疑患者，间隔2周后再次进行血培养，培养结果仍为阴性则排除TM感染。

1.3 方法

1.3.1 临床样本采集采集患者血液2～4 mL置于抗凝管中，800 g离心8 min，沉淀后取上层血浆至冷冻管中，获得样本118份(82例患者无血液样本)，做好编号标记，-80 ℃保存。用咽拭子擦拭患者两腭弓、咽及扁桃处体，获得样本111份(89例患者无咽拭子样本)，置于30%甘油中，做好编号标记，-80 ℃保存。

1.3.3 咽拭子样本的TM抗原检测采用TM抗原试剂盒对111份咽拭子样本进行检测，操作与结果判读同 1.3.2。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 人口学特征及临床特征

整理调查问卷并分析柳州市人民医院感染科于2018年8月—2019年6月确诊的HIV感染者/AIDS患者200例，其中男性148例，女性52例(男女比为2.85∶1)；柳州市160例，来宾市21例，河池市4例，桂林市3例，贺州市2例，百色市1例；汉族130例，壮族65例；81例患者常居城市，119例患者常居农村；未婚32例，已婚125例；56例于户内工作，68例为户外工作者；HIV感染临床分期为Ⅰ期39例(25.8%)，Ⅱ期5例(3.4%)，Ⅲ期41例(27.2%)，Ⅳ期66例(43.7%)(见表1)。20例合并TM感染的患者中，男性19例，女性1例；中位年龄为43岁，其中20～50岁14例；15例来自柳州市，2例来自河池市，2例来自来宾市；15例居住于农村，13例从事户外工作，11例既居住农村又从事户外工作；食用过竹鼠者4例，1例接触过竹鼠。不同CD4+T细胞计数范围的患者TM感染率不同，CD4+T细胞≤50/μL者16例，感染率为29%，50/μL200/μL 的无TM感染，差异有统计学意义(P<0.001)；合并TM感染者的症状以发热(14例，70%)、消瘦(6例，30%)、乏力(6例，30%)、脾大(5例，25%)、咳嗽(5例，25%)、淋巴结肿大(5例，25%)为主，其次有咳痰、皮疹、肝大等症状，详见表2。

表1 患者的人口学特征

表2 患者的临床症状

2.2 实验室检查指标

实验室检查指标主要包括血红蛋白(hemoglobin，HB)、血小板(platelet，PLT)、白蛋白(albumin，ALB)、AST、ALT、AST/ALT、CD4+T细胞等。单因素分析结果显示，相较于HIV-1感染者，20例HIV-1合并TM感染者的CD4+T细胞、淋巴细胞、血红蛋白、血小板、白蛋白水平等明显下降，AST、AST/ALT和D-二聚体等上升(P<0.001)(见表3)。

表3 患者的实验室指标特征及TM感染差异分析

2.3 TM抗原试剂盒检测血浆和咽拭子样本

采用TM抗原试剂盒检测118份血浆样本，均获得有效结果。20例临床确诊的HIV-1合并TM感染者中，15例有血浆样本，其中3例采用试剂盒未测出TM抗原。118份血浆样本中，15份TM结果呈阳性，其中3份与临床诊断不符。此外，有21例患者合并其他病原体感染，其中合并结核分枝杆菌感染10例，真菌感染6例，革兰阳性杆菌/球菌感染1例，奇异变形杆菌、沙门菌、肺炎克雷伯菌感染各1例，肺炎克雷伯菌+白假丝酵母菌感染1例，除1例TM检测阳性，其余均为阴性。以血培养结果为金标准，TM抗原试剂盒检测血浆样本的灵敏度为80.0%，特异度为97.1%，假阴性率为20.0%，假阳性率为2.9%，阳性预测值为80.0%，阴性预测值为97.1%(见表4)。TM检测阳性组A值高于检测阴性组，差异有统计学意义(P<0.001，图1A)。根据患者真实发病情况和预测概率，评估TM抗原试剂盒检测个体是否合并感染TM的准确性。结果显示，其受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)的曲线下面积为0.885(见图1B)。

图1 TM抗原试剂盒检测血浆/咽拭子样本的A值散点图和ROC曲线分析

采用TM抗原试剂盒检测111例咽拭子样本，均获得有效结果。20例临床确诊HIV-1合并TM感染者中，12例有咽拭子样本，其中7例未测出TM抗原。111例咽拭子样本中，5例TM结果呈阳性，均与临床诊断相符。此外，有23例患者合并其他病原体感染，其中合并结核分枝杆菌感染11例，真菌感染6例，革兰阳性杆菌/球菌感染1例，奇异变形杆菌、沙门菌、肺炎克雷伯菌各1例，肺炎克雷伯菌+白假丝酵母菌感染、结核分枝杆菌+金黄色葡萄球菌感染各1例，TM检测结果均为阴性。以血培养结果为金标准，TM抗原试剂盒检测咽拭子样本的灵敏度为41.7%，特异度为100%，假阴性率为58.3%，假阳性率为0%，阳性预测值为100%，阴性预测值为93.4%(见表4)。TM检测阳性组A值高于阴性组，差异有统计学意义(P<0.001，图1C)，ROC曲线的曲线下面积为0.708(见图1D)。

采用 Cohen’s Kappa系数判断血培养与抗原试剂盒检测118份血浆样本中TM的一致性。结果显示，两种方法均检出12例感染TM，100例未检出，同时3例血培养为阳性但试剂盒检测为阴性，3例试剂盒检测为阳性但血培养为阴性。两种方法之间 Cohen’s Kappa 系数为0.771，95%CI为0.595～0.947(P<0.001)，具有较强的一致性。同样，分析两种方法检测111例咽拭子样本中TM的一致性。结果显示，两种方法均检出5例感染TM，99例未检出，同时7例血培养为阳性但试剂盒检测为阴性，无试剂盒检测为阳性但血培养为阴性的标本。两种方法之间 Cohen’s Kappa系数为0.560，95%CI为0.278～0.842(P<0.001)，具有中等一致性。

3 讨论

在中国99%的马尔尼菲篮状菌病患者来自南方，广西壮族自治区占43%，广东省占41%，且其中88%为HIV感染者/AIDS患者[1]。在广西HIV感染者/AIDS患者中，TM感染的患病率为16.1%，仅次于肺炎、肺结核和口腔念珠菌病，且病死率高达17.5%[11]。本研究中，HIV感染者/AIDS患者的TM总体感染率为10%，符合广西壮族自治区HIV-1感染人群中TM感染率为9%～18%的报道[11-12]，以中青年男性居多，且多居住于农村并从事户外工作。广西壮族自治区地理位置属于亚热带地区，气候湿润，适宜TM生长，而HIV感染者/AIDS患者免疫力低下，长期暴露于外界环境中更增加了TM感染的风险。本研究分析临床实验室指标，发现合并TM感染的HIV感染者/AIDS患者中AST、AST/ALT指标值均升高(P<0.001)，表明TM感染者的肝脏损伤更严重。也有研究对TM感染者的临床诊断与影像学检查结果进行分析，发现TM感染可对肝脏造成损伤[10,13]。本研究收集的20例TM感染者的临床症状有发热、消瘦、咳嗽等，但均不具有特异性；出现脐凹样皮疹被认为是马尔尼菲青霉病最具特征性的表现[14]，但HIV感染者/AIDS患者合并TM感染者中出现脐凹样皮疹的仅为少数。尽管血培养的TM检出率相较于痰液、粪便、胸腔积液等标本培养的高，但其培养阳性率仅为76%[6-7]。因此，缺乏典型临床症状使得TM感染发病隐匿[15]，而迅速发展的病情导致未经治疗的患者病死率高达 80%～100%，治疗后病死率仍达30%[1,11,16]。只有早诊断、早治疗才能降低合并TM感染的HIV感染者/AIDS患者的病死率，但临床上广泛应用的血培养或其他标本培养无法达到早诊断的目的，因此新型、经济、高效的TM早期诊断技术对降低发病率和病死率有重要意义。

近年来，研究人员致力于开发TM感染快速诊断技术，新的检测方法层出不穷，例如β-D-葡聚糖测定、半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)试验、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测核酸，以及免疫扩散、乳胶凝集、斑点印迹酶联免疫分析等一系列免疫方法，但效果差强人意[14,17-19]。中国香港大学微生物系在1998年发现了一种可编码TM酵母、菌丝、孢子细胞壁中甘露糖蛋白的基因，将其命名为mp1，其编码蛋白Mp1p可被分泌表达，具有强抗原性且含量丰富[20]。Mp1p作为一种具有高度抗原性的细胞壁甘露糖蛋白[21]，可引发感染者的抗体反应[22]。早期有研究者通过毕赤酵母系统表达重组Mp1p，建立了双抗体夹心ELISA检测Mp1p[23]，并据此在后续研究中建立了一种检测Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA，但灵敏度仅为12.5%[24]。还有研究者开发出可直接检测患者体液中Mp1p蛋白的抗体组合，灵敏度为75%，但检出率仍有待提高[23]。本研究评价的试剂盒采用双抗体夹心ELISA检测标本中的Mp1p抗原，结果显示特异度高达97.1%，灵敏度可达80%，但假阴性率偏高，可能导致漏诊。有研究表明，Mp1p抗原在免疫系统较好的宿主中可被有效清除，抗体检测在免疫力强或体液免疫系统较好的患者中可能更敏感，而抗原检测倾向于对免疫系统受损严重的患者敏感[25]。也有研究认为，与抗原检测方法相比，抗体检测方法阳性率低，主要原因可能是TM急性感染早期血中以抗原为主，抗体尚未产生，而感染后期抗原逐渐降低至阴性[24]。因此，抗原、抗体同时检测能有效提高灵敏度。此外，咽拭子样本已广泛应用于临床各种呼吸道疾病的检测，但检测咽拭子样本中TM的试剂盒还未见发布。本研究采集TM感染者的咽拭子样本，试剂盒检测TM的特异度高达100%，但灵敏度远远不足，可能与咽拭子采样不精确、样本含量低等导致样本中所含Mp1p抗原量更少有关，所以在抗原、抗体联合检测的基础上须进一步提高检出率，而将咽拭子作为TM检测样本或许是未来早期、快速、便捷诊断的发展方向。

本研究通过分析广西壮族自治区柳州市HIV感染者/AIDS患者合并TM感染的流行病学特征，补充了TM感染的临床流行病学数据。TM抗原试剂盒检测血浆样本的特异度高，灵敏度良好，假阳性率低。但本研究样本局限于HIV感染者/AIDS患者，未能纳入非HIV感染者/AIDS患者的TM感染者，因此对TM抗原试剂盒的评价不够全面，须进一步研究。本研究还发现，HIV感染者/AIDS患者CD4+T细胞计数越低，TM感染率越高。当CD4+T细胞≤50/μL时，TM感染率高达29%，远高于总体感染率。因此，建议临床上对CD4+T细胞计数低的AIDS患者及时进行Mp1p抗原及抗体检查，以便早发现、早治疗，从而降低TM感染者的发病率和死亡率。