茶叶中吡咯里西啶生物碱检测技术、污染水平及健康风险研究进展

韩浩蕾，姜长岭，王 晨，刘 新，鲁成银，陈红平,*

（1.中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.农业农村部茶叶产品质量安全风险评估实验室，浙江 杭州 310008）

茶是世界上最受欢迎的无酒精饮料之一，茶叶具有田间生长周期长、加工过程复杂、贮存时间长等特点，易受到农业投入品、生物毒素、环境污染物、重金属等有毒物质的污染[1]，这些有害物质已成为茶叶质量安全潜在危害因子。茶叶中有害物质污染途径主要来源于种植与加工阶段（图1）。其中种植阶段产地环境产生的污染物可经大气沉降、土壤吸收以及随水传播等途径，造成茶叶（叶片、根系）被有害物质如高氯酸盐、多环芳烃等环境污染物[1-2]污染，产地和周边环境中的农药残留（甲胺磷、乙酰甲胺磷等）[3]以及工业排放、金属矿山开采等活动形成的重金属，均会在大气、土壤、水和植物之间相互扩散后，随着空气沉降、土壤吸收以及污水灌溉造成茶叶污染[4-5]。近些年环境中的植物毒素、真菌毒素等污染物及其污染茶叶途径也广受关注[6]。

图1 茶叶种植加工阶段有害物质污染途径Fig.1 Pathways of harmful substance pollution in tea planting and processing

吡咯里西啶生物碱（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物的次级代谢产物，主要分布于远缘相关的被子植物科，涉及菊科、紫草科和豆科等13 个科，通常集中在植物的种子和开花部位，其叶、茎和根中的含量较低。不同植物种类中PAs的质量分数相差较大，从痕量到高达19%（以干质量计）[7-8]。PAs具有化学防卫的功能，在一定程度上可抵御草食动物、昆虫和植物病原对植物的侵害。一些含PAs的植物常被用作地被植物、土壤改良剂（豆科）、观赏植物和动物饲料。目前已经在超过6 000 种植物（可能占所有开花植物的3%～5%）中鉴定出660多种PAs及其氮氧化物（pyrrolizidine alkaloidN-oxides，PANOs）[9-10]。

PAs是一类植物毒素，茶叶本不含有PAs，因茶园存在含PAs的植物（如一点红、千里光等），其种植阶段可能通过土壤、水等间接污染茶叶。前期研究证明茶园中的杂草——千里光属植物根部PAs会污染土壤，博士茶根系会吸收PAs而受到污染[6,11]；茶叶采摘和加工阶段可能混入含PAs的植物而形成污染。目前，在奥地利、德国、比利时等许多欧洲国家已经对茶叶中PAs或PANOs的污染起源与途径进行了大量的研究，建立了较为完善的茶叶检测与监督体系[7]，同时将茶叶PAs含量列为出口到其他欧盟国家的重点关注参数，PAs成为近年来我国茶叶出口受阴的主要污染物之一。然而，我国目前针对茶叶中PAs的研究相对较少，缺乏茶叶中PAs污染水平基础数据，无法获得茶叶中PAs污染来源，导致我国对茶叶PAs管控处于极度被动状态。

1 PAs的化学结构与毒性

PAs化学结构一般由千里光次碱和千里光次酸两个基本部分组成（图2）。千里光次碱的吡咯环结构为PAs的母核，由两个稠合的含氮五元环状结构组成，该部分可被杂酸酯化形成单酯、开链双酯或大环双酯，当C2、C6或C7上带有一个或两个羟基时，可导致其形成立体异构体[9]。当千里光次碱中N被氧化时，可形成相应PANOs，与PAs同时存在于植物体内[8,12]。PAs在植物体内合成的相关研究有限，到目前为止，仅一种与PAs生物合成有关的酶被表征，即高精胺合酶，其参与催化PAs生物合成的第一步[13]，随后经过氧化、环化、还原、酰化等一系列反应，先生成初级产物PANOs，继而合成相应PAs。图3为千里光宁碱的生物合成过程[8,13]。

图2 不同PAs及吡咯代谢物化学结构Fig.2 Chemical structures of PAs and pyrrole metabolites

图3 PAs合成途径[8]Fig.3 PAs synthesis pathway[8]

根据千里光次碱在1、2位碳原子之间形成的键是否饱和，可将PAs分为饱和PAs和不饱和PAs两大类，饱和PAs一般无毒或毒性弱，而不饱和型PAs因其毒性和致病性成为关注热点[9-11]。不饱和PAs被CYP 3A氧化成烯丙醇酯结构的吡咯代谢物（图4）后会引起肝毒害作用[8,14]。20世纪30年代，PAs引发人类肝中毒的暴发性案例导致PAs的肝毒性受到世界各地的广泛关注。PAs除具有肝毒性外，还有研究表明部分PAs具有肺毒性、致癌性、遗传毒性及致畸胎作用等多种毒性[15-17]。除此之外，最新研究表明PANOs亦可产生毒性[18]。人体主要通过摄入含PAs的食品而引起健康风险[19]。因此，研究食品中的PAs类物质的污染水平及来源，并对其进行合理监测以及风险评估对于保障食品安全具有极其重要的作用。

图4 PAs的代谢活化[14]Fig.4 Metabolic activation of PAs[14]

2 茶叶中的PAs检测技术

复杂基质中的PAs检测技术从常量定性分析向痕量残留定量分析的方向发展，植物源样品中PAs检测经历了分光光度法[20]、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法[21]、免疫学方法[22]等定性定量分析方法，逐渐发展到高灵敏色谱法和色谱-质谱联用（包括液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）与气相色谱串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS））精准分析技术[10]。分光光度法中的比色检测仅能针对PAs进行总量分析，无法量化单一PA，且对复杂基质中PAs的痕量分析缺乏敏感性和选择性[9-10,23]。NMR法主要用于PAs的结构鉴定，具有快速、精密度好的特点，但NMR灵敏度较差，难以进行痕量分析[10,21]。免疫学检测过程中，PAs通过共价结合与蛋白质快速反应，形成吡咯-蛋白质加合物，可以快速、灵敏地检测复杂基质中的分析物，更多用于PAs毒理方面的研究[22]，但其缺点是仅对与千里次光碱结构密切相关的PAs（如十二元大环酯，但没有烯酮、开链酯或十一元或十三元大环PAs）敏感，难以适用于所有PAs检测，且容易受到复杂基质干扰[7,10]。目前，色谱与质谱联用技术在PAs分析中选择性好、灵敏度高，且适用于同时检测多种PAs，因而广泛用于农产品或食品中PAs的定性定量分析[7,9]。表1总结了近年来色谱-质谱检测技术在茶叶中PAs检测的应用，可以看出，在分析手段方面，相较于GC-MS/MS，LC-MS/MS依旧是目前PAs检测方法中最主流的检测手段；在前处理技术上，固相萃取（solid phase extraction，SPE）是最常用的净化处理方式。

表1 茶叶PAs检测前处理方法及检测技术Table 1 Pretreatment methods and analytical techniques for the detection of PAs in tea samples

2.1 前处理技术

PAs是含有特征性碱性氮的还原性生物碱，通常使用半极性或极性有机溶剂或在酸化水条件下萃取PA，其氧化形式（PANOs）属于极性分子，容易被极性溶剂（例如甲醇）或稀酸溶液萃取[30]。茶叶中PA前处理技术主要包括液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）、SPE以及SLE（表1），也可开发常用前处理方法如QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）法以及新型前处理方法如分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）法等对茶叶进行提取及净化。

2.1.1 液液萃取

LLE是一种传统分离PAs的方法，其基于相似相溶原理，根据目标分析物在液相之间的溶解度差异进行分离[31]。PAs分离过程首先将提取液酸化，生物碱将以离子的形式存在于水相中，为除去叶绿素和其他弱极性物质，用乙醚、氯仿等有机溶剂萃取，再将水层碱化，释放生物碱，再用相同或相似的有机溶剂（氯仿、二氯甲烷）萃取达到分离纯化的目的[23]。但LLE操作过程繁琐，不能同时分离纯化PAs及PANOs，且因极易出现乳化现象，PAs损失较多，不符合对PAs进行痕量分析的要求。该方法目前已经使用极少，逐渐被SPE所取代[23,32]。

2.1.2 固相萃取

SPE是被广泛用于提取包括农药化合物在内的污染物的前处理方法。SPE基于吸附剂与分析物之间的相互作用将分析物吸附到固体吸附剂上，在去除杂质的同时，实现样品的富集净化，具有溶剂用量少、高效、快速的特点，是目前使用最广泛的纯化PAs的方法。其纯化步骤通常为首先活化SPE柱，上样后分别采用甲醇和去离子水淋洗，最后利用碱性溶液（如含有氨水的甲醇溶液）进行洗脱。常用的SPE柱有C8柱、C18柱、阳离子交换色谱柱（solid phase extraction column，SCX），其中SCX-SPE柱的使用可以有效去除弱极性与离子型极性干扰物质，同时满足PAs和PANOs回收率要求[7,32]。Kaltner等[24]利用SPE技术建立了一种定性定量茶叶中4 种PAs/PANOs的方法，比较了6 种不同型号SPE柱（Bekolut SCX、Discovery DSC-18、Chromabond SA、Strata-X-C、Bond Elut SCX、Bond Elut Plexa PCX）的净化效果，结果发现Bond Elut Plexa PCX柱效果最佳，对茶叶中36 种PAs的回收率达到60%～120%。

Chung等[27]对食品（包括谷类食品、乳制品、肉、蛋、蜂蜜、茶浸液和香料）中的15 种PAs和13 种PANOs进行检测。前处理方法采用C18柱SPE净化、水/乙腈淋洗去除复杂基质后，用甲醇洗脱大部分PAs/PANOs，奥索千里光裂碱型PAs因需要在碱性介质中才能完全洗脱，用体积分数2.5%氢氧化铵-甲醇溶液洗脱，最后混合洗脱液提取全部目标PAs/PANOs。所有食品PAs和PANOs的回收率为50%～120%，茶浸提液中回收率达77%～116%。该方法成功地将SPE技术应用于复杂基质中的多种PAs痕量检测，为建立食品中多种PAs痕量分析方法提供了重要支撑。

SPE方法作为使用最普遍的前处理技术，可在其基础上进一步优化净化过程中影响清洁效果的参数，如溶剂组成、吸附剂、流量等，或是以串联SPE柱的方式来提高净化效果。

2.1.3 QuEChERS法

QuEChERS法是2003年美国Anastassiades等[33]提出的一种农产品农残检测的前处理方法，发展迅速，已成为目前色谱及色谱质谱分析前处理应用最广的前处理技术之一。QuEChERS法将提取与纯化同步进行，其核心是采用分散固相吸附剂去除干扰物质，具有操作简单、快速、环境友好、兼容性强的优点，且适用于高通量检测与样品前处理，因而在对植物源农产品农药残留、PAs等痕量分析中得到广泛应用[31]。

Martinello等[34]采用QuEChERS方法建立了一种简便快速定量检测蜂蜜中PAs的方法。该QuEChERS方法采用10 mL乙腈和QuEChERS EN方法（柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠倍半水合物0.5 g、硫酸镁4 g和氯化钠1 g）进行提取净化，再结合适量的N-丙基乙二胺键合硅交（primary secondary amine，PSA）、硫酸镁和碳进行吸附净化，离心过滤后结合UPLC-MS/MS检测，结果的检出限为0.21～1.39 mg/kg，回收率为73%～109%。Kaczyński等[35]采用一种超声辅助QuEChERS方法提取和纯化草药中PAs，该研究表明使用PSA、C18、石墨化炭黑和MgSO4吸附剂会降低PAs回收率，可能是吸附了具有弱酸性的PAs所致，而将石墨烯用作吸附剂时，可以获得好的净化效果，且不会影响其回收率。

茶叶作为复杂的基质，目前鲜见其相关的QuEChERS前处理方法，但QuEChERS作为使用广泛的前处理技术，灵活性高、适用性强，可通过对不同吸附剂的组合、提取溶剂的选择等进行优化[31,36]，形成高效的改进QuEChERS方法，以对茶叶中PAs进行检测。

2.1.4 其他方法

基于LLE和SPE的新型技术如DLLME、SLE被应用到PAs分析前处理中。DLLME是一种功能强大的预浓缩技术，具有操作简单、成本低、萃取时间短、富集因子高、有机溶剂消耗适中等众多优点[37]。Celano等[38]利用DLLME结合UPLC-MS/MS检测蜂蜜中PAs，相比于应用SPE和QuEChERS，提高了PAs的富集效果；再与UPLC-MS/MS结合，得到了更低的检出限（0.01～0.02 μg/kg），回收率为71%～102%。DLLME具有绿色环保的优点，且可通过结合其他技术进一步提高方法的准确度。因此，该技术可被逐渐应用到茶叶、草药等复杂基质多种PAs痕量分析中。

SLE是对目标物质进行固相表面支撑的LLE，相对于SPE，有不需要进行调节、平衡或者冲洗SPE柱等优势，可缩短处理时间。Mathon等[25]使用SLE结合HPLC-MS/MS检测茶叶和草药茶中的PAs和PANOs，得到的定量限为0.1～0.5 μg/kg，回收率为91%～114%。该方法虽然成功应用于茶叶和草药茶中PAs和PANOs的检测，但这种方法不可直接用于不可电离的PAs如千里光宁碱氮氧化物，因此对于同时检测多种PAs方法的建立具有一定局限性。

随着前处理技术的不断发展，目前一些新型前处理技术不断应用于生物碱的检测分析[32]，如固相微萃取[39]、分子印迹法[40]等。新型前处理技术具有去除干扰能力强、灵敏度高与环保等特点，有望应用于茶叶等复杂基质中PAs的分离纯化，提高检测方法的抗干扰能力和灵敏度，且新型的前处理技术未来将可能成为多种PAs痕量分析的主要趋势。

2.2 PAs分析技术

2.2.1 气相色谱和气相色谱-质谱联用

GC-MS分析PAs的方法最早于20世纪90年代开发并应用于天然来源物质（植物和昆虫）的PAs检测[41]。游离PAs通过GC进行分离，并使用不同的固定相根据相对保留时间进行鉴定，这种方法适用于除奥索千里光裂碱型以外的大多数PAs。由于PANOs在GC挥发温度下不易挥发，不适合用此方法鉴定，因此可先通过化学转化如使用Zn+/H+将PANOs还原为游离PAs进行检测[9-10,30,42]。GC-MS通常用电子轰击电离（electron ionization，EI），PAs经EI源轰击后产生碎片离子，通过选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）和全扫描模式，定性定量分析复杂基质中的PAs[41]。由于多羟基PAs在GC条件下难挥发，不能直接采用GC和GC-MS进行分析，因此需采用衍生化的方法将多羟基PAs衍生产生挥发性产物，通过PAs与衍生物之间的量化关系定量分析PAs。多羟基PAs常用衍生试剂是邻二醇的硼酸衍生物或三甲基硅醚或二者的组合[9,42-43]。

Kempf等[42]提出一种采用GC-MS法检测蜂蜜基质大多数1,2-不饱和PAs的方法。该方法通过酸性液体萃取，用锌粉将PANOs还原为游离PAs，经过SPE净化后，使用LiAlH4将1,2-不饱和PAs还原以产生共同的骨架结构（千里次光碱结构），再用N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，MSTFA）进行衍生化反应（图5），最后通过GC-MS在SIM模式下分析所得的衍生物。这种方法通过还原和衍生化将所有不饱和PAs转化为同一种类型化合物（倒千里光裂解型），结果用单一的总和参数表示，结果的定量限为0.01 mg/L。该方法后来也同样适用于许多基质，如蜂蜜、花粉和植物等[10,44]。Kowalczyk等[45]基于上述前处理技术使用七氟丁酸酐作为衍生化试剂，结合GC-MS法检测蜂蜜中1,2-不饱和PAs含量，结果回收率为73.1%～93.6%，定量限为1 μg/kg。

图5 千里光裂碱还原及衍生化反应[42]Fig.5 Reduction and derivatization of senecionine[42]

衍生化过程用于GC-MS法分析PAs虽有提高灵敏度的优势，但过程繁琐、耗时长；且GC-MS法分析PAs存在稳定性差、检出限高等缺陷，目前PAs分析较少使用GC及GC-MS，LC及LC-MS是PAs的主要分析手段（表1）。

2.2.2 液相色谱、液相色谱串联质谱和液相色谱-高分辨质谱

LC与LC-MS方法不仅可以同时检测PAs和PANOs，且具有灵敏度高、检测限低、适用范围广、重复性好、操作方便、前处理简单等优点，是目前使用最广泛的方法[30,44]。游离碱PAs包括中等极性与极性化合物，而PANOs为极性化合物，因此LC柱固定相应选择极性较小的键合固定相，如C18、C8反相色谱柱；流动相系统常选用甲醇/水系统和乙腈/水系统，并使用酸或碱作为水性洗脱液的改性剂来提高分离度[7,9]。PAs因存在多个立体异构体（如印美定/石松胺）导致色谱峰分离度较差，可选用分离度更高的色谱柱改善，如HPLC色谱柱、UPLC色谱柱[46]。

LC-MS/MS中电离源的电离方式通常采用ESI或大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ion source，APCI）两种技术[30]。其中ESI应用更为广泛，PAs和PANOs在ESI作用下形成分子离子峰[M+H]+；APCI对游离PAs分析虽有良好的稳定性，但对PANOs的灵敏度低[7,10,30]。样品经电喷雾电离后，进入MS检测，离子阱或三重四极杆已广泛应用到其MS的分析中，通过分析在离子源中形成的加合离子碰撞诱导解离片段来开发PAs特定的MS方法，例如选择反应监测、多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）或前体离子扫描等[9,10,47]。

Yoon等[48]通过LC-ESI-MS/MS结合冷冻脂质沉淀和SCX-SPE测定高脂食品中的9 种有毒PAs。该研究基于PAs的[M+H]+的MS/MS碎片化路径，在MRM模式下选择PAs的质子化分子作为前体离子，裂解后丰度最高或第二高的离子作为产物离子，以对基质中的PAs进行定性和精确定量。图6为部分PAs的[M+H]+离子的MS/MS碎裂途径。此分析方法检出限达0.06～0.60 ng/mL，分析物的平均回收率在低质量浓度（10 ng/mL）下为81.59%～104.92%，在高质量浓度（100 ng/mL）下为82.06%～105.41%。使用LC-MS/MS MRM模式对PAs进行定性及痕量分析，可以在复杂基质中显著提高PAs的检测灵敏度、精密度、选择性及准确性。目前LC-MS应用广泛，也是痕量分析茶叶中PAs最普遍的技术，具有广阔的应用前景。

图6 部分PAs [M＋H]＋离子MS/MS裂解途径[48]Fig.6 Partial PAs [M + H]+ MS/MS fragmentation pathway[48]

LC和LC-MS/MS具有许多优点，但也有局限。研究中多数方法都使用目标MS/MS设置，会遗漏相关的PAs；市场上用于准确定量（认证的）且可以商购的参考标准品PAs大约只有50 种，可用的PANOs标准品数量甚至更少，同位素标记的化合物也无法商购，基于无相应的参考标准，研究中只能在大的不确定性下获得定量结果。在此情况下，使用液相色谱与高分辨质谱的联用技术（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）对PAs相关物质进行结构筛选（“非目标”筛选）具有重大意义[7,9-10]。

在LC-MS联用的快速发展中，HRMS已经应用到MS中形成新的检测方法。如液相色谱-四极杆-轨道阱质谱（liquid chromatography-Q-Exactive Orbitrap mass spectrometry，LC-Q Exactive-MS）[49]、超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-ESI-Q-TOF-MS）[50]、亲水液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（hydrophilic interaction liquid chromatography quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，HILIC/ESI-Q-TOF-MS）[51]、液相色谱多模式化-飞行时间质谱（liquid chromatographymulti mode ionization-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，LC-MMI-TOF-MS）等[52]，这些工具都具有高分辨率、高精度、高质量准确度及极高的灵敏度的优势，可以基于LC-HRMS的方法来分析没有参考标准但已知结构的PAs[9]。Q-TOF-MS是目前使用普遍的高分辨质谱，可通过建立每种PAs的碎裂过程来表征痕量化合物[36]。Jeong等[50]开发并验证了一种使用UPLC-ESI-QTOF-MS快速准确测定植物样本中9 种PAs的方法，并证明UPLC-ESI-Q-TOF-MS可提供准确的前体和碎片离子质量信息并同时定量，检出限达0.4～2.0 ng/mL，定量限为0.6～6.0 ng/mL，此外还表征了70 种PAs及PANOs的前体离子及其生成的特征性碎片离子。Martinello等[49]研究发现混合四极杆轨道阱高分辨质谱结合了四极杆质量分析器对前体离子选择的高性能和静电场轨道离子阱检测的高分辨率，与Q-TOF-MS和TOF-MS相比可实现更高的分辨率。

HRMS的应用作为筛选方法有巨大优势，与传统的MS/MS相比，HRMS降低了对色谱分离的要求，可实现高通量分析[9]；LC与HRMS联用可全面获取样品中PAs的精确分子质量和碎片离子信息，区分同分异构体，鉴定未知物[53]，是对多种PAs痕量分析的有效检测手段[9,36]。

3 茶叶中PAs的污染水平

目前茶叶中的PAs检测技术已经相对成熟，针对茶叶中PAs造成的食品安全质量问题与健康风险，许多国家对市场中的不同茶叶开展了PAs污染水平监测与风险评估研究，欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）调查结果表明，（草药）茶等物质是人体暴露PAs/PANOs的重要来源之一[54]。表2列举了近年来不同国家茶叶中PAs的污染水平。

表2 不同国家茶叶中PAs水平Table 2 PAs contents in tea from different countries

3.1 不同国家茶叶PAs污染水平的差异

目前PAs污染茶叶已成为全球性问题[11]，欧美国家尤其是德国已重点监测了花草茶中PAs污染水平。与其他国家相比，德国近几年市售花草茶中检出PAs含量较低。Kaltner等[24]在德国检测市售茶中44 种PAs/PANOs化合物的含量，分别检查了3 个品牌6 种花草茶（薄荷茶、绿茶、红茶、茴香茶、甘菊茶和博士茶）的PAs含量，18 个样品中PAs的含量范围为0.1～47.9 μg/kg。德国对食品中PAs有严格的风险评估与控制策略，自1992年以来，含PA的植物药物已受到《联邦制药条例》的管制，近些年来为加强食品中PAs污染的控制，德国联邦风险评估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）已使用几种消费情景对儿童和成人食用（草本）茶中的PAs进行了初步风险评估，发现长期食用某些类型的（草药）茶浸液会增加健康风险，建议消费者对来自各种食品的PAs摄入量需保持低水平[58]。Mathon等[25]检测瑞士市场花草茶PAs含量时，发现PAs整体含量相对较低，其中茴香茶、红茶、绿茶中PAs含量低于方法检出限，但据某些样品检测结果推测人类饮食后会超过BfR和英国毒性委员会建议的最大每日摄入量（0.007 μg/kg），长期饮用亦会造成健康风险。比利时、以色列、爱尔兰等其他国家针对市售花草茶中的PAs污染水平监测中，（草药）茶中含有类型广泛的PAs/PANOs，且某些PAs含量较高，存在严重质量安全隐患。我国目前对农产品中PA污染与风险评估主要集中于含PAs的植物和蜂蜜，对其他农产品研究甚少，缺乏系统性风险排查以及风险评估研究，最大残留限量等安全评价指标也因此处于缺失状态。

3.2 茶叶中的PAs种类

茶叶中的PAs/PANOs主要包括千里光宁碱型、石松胺型、天芥菜碱型、野百合碱型以及奥索千里光裂碱型5 种类型，其中千里光宁碱型PAs是花草茶污染中最主要的化合物，占茶叶中PAs总含量77%以上；石松胺型、天芥菜碱型PAs分别约占总含量的14%和8%[10,29]。此外各类茶叶中普遍发现有千里光宁碱、千里光宁碱氮氧化物、倒千里光碱氮氧化物、印美定、印美定氮氧化物、石松胺、千里光菲灵碱、千里光菲灵碱氮氧化物8 种污染物[54]。Mulder等[57]研究表明千里光宁碱氮氧化物是茶叶中最主要PA，含量范围约为60～200 μg/kg，约占茶叶中PA总含量的50%。

3.3 不同茶叶中的PAs种类及污染水平

不同茶叶类其PAs组成不同。EFSA科学报告评估表明，在茶浸出液样本中，绿茶和红茶均有4 种主要PAs且含量分布均匀，绿茶中主要PAs类型包括千里宁光碱氮氧化物（19%）、倒千里光碱氮氧化物（18%）、印美定（16%）和石松胺（16%）；红茶中PAs主要由印美定氮氧化物（31%）、印美定（20%）、石松胺（20%）和倒千里光碱-氮氧化物（15%）组成；洋甘菊茶中千里光宁碱氮氧化物、印美定为主要检出PAs，分别占28%和22%；博士茶中主要有3 类检出PAs，其中千里光宁碱氮氧化物为最主要PAs，约占总PAs含量57%，倒千里光碱氮氧化物以及千里光宁碱分别占19%和16%[54]。

不同茶类PAs污染程度也不同。总体来看，博士茶中PAs污染最为严重，其次是花草茶和红茶，绿茶以及其他茶叶中含量相对较低（表2）。Bodi等[59]分析了德国市场上6 个茶类总共274 种干茶样品（包括红茶、绿茶、博士茶、薄荷、甘菊和混合茶）中PAs含量，其中博士茶PAs污染最为严重，平均含量为1 856.4 μg/kg，最大含量高达5 647.2 μg/kg。博士茶污染源被鉴定为可能是茶园里的杂草PA植物千里光，van Wyk等[6]发现在无杂草场所收集的博士茶中均未检出PAs，在富含杂草千里光的场所中博士茶受到严重污染且其含有与千里光相同类型和比例的Pas。研究证实了PAs主要通过污染土壤而间接污染博士茶[6,57]。欧洲花草茶污染水平监测发现，甘菊茶和蜂蜜茶中PAs含量较高且PA类型分布均匀[26,56]，爱尔兰一项调查检出甘菊蜂蜜茶中PAs总量平均值可达245 μg/kg[26]，以色列花草茶监测发现洋甘菊茶中PAs污染量高达564 μg/kg[56]，究其原因可能是一些花草茶配料、蜜源植物（如向日葵、紫云英、苜蓿、苕子）是典型的含PAs植物，则含有PAs植物和蜂蜜的花草茶易受到污染[12]。在各项监测中茴香茶、绿茶、红茶中PAs检出含量较低（表2），但红茶中PAs含量普遍高于绿茶[25,56]，EFSA在2016年的监测中发现红茶中PAs浓度为绿茶中的2 倍[60]；黄茶、乌龙茶、普洱茶等中的PAs含量低甚至不超过方法检出限[26]，推测不同茶类间PAs种类及污染水平差异可能与其茶叶采摘、加工方式有关。

3.4 茶叶与其他食品或农产品中PAs差异

目前，PAs在蜂蜜、茶叶、谷物、牛奶、鸡蛋、肉类以及饲料等多种食品和农产品中均能检出。蜂蜜及其衍生产品是研究最广泛的食品，且其中PAs检出含量高，主要原因是花粉PAs浓度与原始PAs植物组织相近[61-62]，PAs可通过花粉意外引入花蜜污染蜂蜜及其衍生产品[63-64]；含PA的草药和被PA植物意外污染的草药、谷物以及香料中PAs检出含量也均较高[7,10]；在动物源性食品（肉类、鸡蛋）中仅有痕量PAs在少数情况下可被检测到[57]，其污染来源为动物觅食的牧场和田地中可能存在PA植物和含PAs的饲料产品（如苜蓿），这部分PAs可被转移到动物衍生的食品中[10,54]，Mulder等[65]研究表明产蛋鸡摄入含PAs的草药可能将PAs转移入鸡蛋和鸡肉中，导致其受到污染。

与其他食品和农产品相比，茶叶PAs污染范围广、污染程度较高且及浓度变化范围大。Mulder等[57]对欧洲6 个国家动植物源性食品中PAs的污染水平进行调查，有92%的（草药）茶均含有可检出的PAs，且含量高，平均含量可达460 μg/kg（以干基质量计），其中大多数花草茶中检出PAs含量高，而部分红绿茶中检出PAs含量低。

4 茶叶中PAs健康风险

4.1 PAs的急性毒性与慢性毒性

目前已有相关机构评估了受PA污染食品（包括茶叶）和基于PA植物生产的食品补充剂所造成的急性毒性及慢性健康风险[54,58-59]。PAs及其氮氧化物具有肝毒性、肺毒性、遗传毒性、生殖毒性、致癌性、致突变等一系列毒性作用[66]。

PAs可引起急性肝毒性，其症状是出血性坏死、肝肿大、腹水和肝功能异常，最终可能导致死亡[66]。目前已有两例发生在婴儿当中的临床病例可以提供可靠的短期暴露剂量效应关系信息[67-70]，6 个月大的女婴每天摄入PAs大约0.8～1.7 mg/kgmb持续2 周，被诊断出肝静脉闭塞性疾病（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）。HVOD是由PAs中毒引起的肝脏损伤，能导致肝硬化和肝功能衰竭，被认为是PAs暴露的表现[66]。调查发现，一个2 个月大的男婴每日服用PAs 3 mg/kgmb约4 d发生了致命的后果[69]。这些病例报告列出了短期（4～14 d）暴露PAs后中毒和死亡相关的最低剂量范围，可得出结论：对于人类，短期暴露PAs后与肝脏不良反应相关的最低已知剂量为每天0.8～1.7 mg/kgmb[7,54,58]。EFSA食品链污染物小组根据病例得出每天摄入PAs 1～3 mg/kgmb持续4 d～2 周，可产生急性毒性，且考虑到PAs对人的潜在毒性及其影响的严重性尚不确定，与上述剂量范围相比，暴露水平在100 倍以下亦有急性/短期影响的风险[54]。

临床实验中，PAs的毒性作用具有累积性[71]。亚急性或慢性低水平的PAs暴露可能导致肝损伤，如纤维化、结节性再生和肝硬化[66]。目前，茶叶是人体PAs暴露的主要因素之一，因此消费者因食用茶和凉茶等高消费量食品而频繁或长期暴露于PAs，可能对人体健康造成危害。利用Riddelliine对大鼠的致癌性实验得出：以10%响应的基准剂量可信下限（benchmark dose limit with a 10%，BMDL10）可作为评估长期暴露于PAs的风险参考点[60,66]。2017年EFSA重新采用暴露限值（margin of exposure，MOE）方法[54]结合基于Riddelliine在大鼠中的致癌性实验[68]和之前的风险评估结果[73]得出：以BMDL10（每天食用237 μg/kgmb）作为PAs慢性风险评估的参考点。

鉴于食品中PAs对人体健康的潜在危害，已有多国制定了食品中PAs最大允许含量的相关标准或措施[10]。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）早在1989年建议PAs日摄入限制量为15 μg/kgmb[74]；BfR建议PAs每日最大摄入量为0.007 μg/kgmb[58]；欧洲药物管理局建议PAs的成人日摄入量最高为0.35 μg/kgmb，儿童为0.007 μg/kgmb[75]；2020年，欧盟设置茶叶中21 种PAs含量限量为成人150 μg/kgmb、婴幼儿75 μg/kgmb[76]，美国食品药品管理局禁止含PAs的紫草科植物用于食品加工业。目前我国尚未对PAs摄入量做出明确规定与建议。

4.2 PAs理化性质及其在茶汤中的浸出特性

茶叶中的PAs主要通过茶汤被人体吸收从而造成健康风险，因此进行茶叶中PAs风险评估时应考虑其浸出特性[77]。Picron等[29]测定植物性食品（包括茶叶）中PAs在浸泡过程中的转移率发现，根据化合物的不同，在浸泡过程中只有16%～28%的PAs/PANOs污染物从干物质转移到了浸泡液中。PAs的结构特性和极性不同会导致浸出特性差异，PAs化合物极性越大，在水中浸出率越高，如PANO极性大，有更高的浸出率；PAs化合物浸出率与水溶解度也呈正相关；但因辛醇/水分配系数低的物质，亲水性较高，推测PAs化合物辛醇/水分配系数与其浸出率呈负相关。此外，根据茶叶中污染物以及内含物质在冲泡过程中的浸出规律[76]推测茶叶冲泡方式（冲泡温度、冲泡次数、冲泡时间等）也会影响内源污染物PAs实际浸出率。

4.3 茶叶中PAs对人体的暴露水平及健康风险

EFSA对欧洲人群中PAs的膳食暴露评估，茶和草药的摄入是造成PA暴露总量的主要因素[60]。随着茶叶消费量近年逐渐增长，茶叶中PAs对人体的暴露水平增加。年轻人（婴幼儿、儿童）和成年人通过消耗茶和草药（茶）而引起的长期慢性暴露量范围分别为每天34.5～48.4 ng/kgmb和31.1～41.8 ng/kgmb，其估计值均高于其他食品，长期摄入会有慢性风险；高暴露人群因消费大量高暴露水平茶类（如博士茶）亦会有急性毒性风险[60]。

不同茶类健康风险不同，推测博士茶、薄荷茶、红茶属于健康风险较高的茶类，因为博士茶和薄荷茶在多项监测中PAs平均含量及暴露水平均较高[57,59-60]，而红茶不仅PAs暴露水平较高，还含有毒性较大的石松胺类PAs和印美定类PAs[78]。结合Chen Lu等[79]进行的风险评估，博士茶、薄荷茶、红茶3 种茶MOE普遍小于10 000，认为其均存在慢性风险。红茶、博士茶因对成年人的暴露水平更高，推测其风险更大。除上述3 种茶类，根据茶叶中PAs的最大检出含量与暴露水平推测，若大量食用绿茶、混合凉茶以及甘菊茶也会对人群造成健康风险。因此，茶叶中PAs的健康风险与茶叶PAs暴露水平、PAs分布以及人类的膳食结构均有关，建议人们应建立合理的饮食习惯，保持均衡和多元化，避免因偏食或过度饮食某类茶叶而摄入过量的PAs。

5 结 语

PAs是一类植物次级代谢产物，不饱和PAs及大部分PANOs具有多种毒性作用。茶叶基质复杂，茶叶中PAs检测前处理技术主要包括改良QuEChERS和SPE法，LCMS/MS是检测PAs的主要手段。茶叶普遍受到PAs的污染，其污染水平与茶叶产地、种类相关。茶叶中PAs主要包括千里光宁碱型、石松胺型、天芥菜碱型等，其中千里光宁碱氮氧化物污染最为严重，约占PAs总含量50%。茶叶中PAs主要通过茶汤被人体吸收，从而对人体健康产生危害。目前，根据科学风险评估欧盟等国家制定茶叶中PAs最大允许含量，并将PAs作为茶叶进口重点关注和检测参数，对我国茶叶出口贸易产生严重影响。我国尚未制定茶叶中PAs检测方法标准和最大允许含量相关标准，风险评估数据处于缺失状态，亟待开展茶叶中PAs风险评估与管控研究，确保我国茶叶质量安全，降低PAs超标对我国茶叶出口造成的巨大经济损失。