周子丹,彭文君,倪家宝,毕延祥,方小明,*,刘素纯,*
(1.湖南农业大学食品科学技术学院,湖南 长沙 410128;2.中国农业科学院蜜蜂研究所,北京 100093)
蜂花粉是由工蜂通过花朵与其身体之间产生的弱静电场来收集花粉粒,并通过唾液分泌物和花蜜浸湿凝结成粒径约1.4~4 mm的扁圆形团状物[1]。蜂花粉含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂类、维生素、矿物质和许多天然活性物质,是一种具有高潜在生物价值的食品,被称为“天然微型营养库”[1-2]。由于新鲜蜂花粉水分质量分数较高(可达到30%),并且有高度吸湿性,易黏结成团,甚至容易受到微生物污染[3]。干燥是解决这些问题的最有效方法之一,并有利于提升蜂花粉产品品质和附加值。
蜂花粉干燥过程涉及热交换、失水、氧气、光照等因素,其间发生一系列复杂的理化反应,是影响产品品质的关键环节。目前常用的蜂花粉干燥方式有自然晾晒、热风干燥、红外干燥、冷冻干燥等。Estevinho等[4]比较了热风干燥和冷冻干燥对蜂花粉脂质、VC、β-胡萝卜素的影响,发现冷冻干燥可更好地保存生物活性成分;Isik等[5]采用红外干燥对蜂花粉进行处理,结果表明随着红外功率的增加,干燥时间显著缩短,蜂花粉表面的形态变化增大,且50 W红外干燥比其他功率水平更能保持蜂花粉的蛋白质、脂肪、总碳水化合物和VC等品质指标含量。干燥温度为45 ℃时,真空脉动干燥能减少荷花蜂花粉的色泽劣变,同时能较好地保持蜂花粉颗粒微观结构的完整性[6]。Song Xiaodong等[7]探究了热风干燥温度对荷花蜂花粉色泽、抗氧化活性和脂质氧化的影响,结果表明40 ℃时能最大限度地保留荷花蜂花粉的营养成分。因此,不同干燥处理会导致蜂花粉产品的色泽、生物活性成分、抗氧化活性和微观结构等产生变化。但关于不同干燥方式对蜂花粉品质特性和微观结构的影响研究相对不足。
微观结构与宏观品质特性(如色泽、外观形态等)密切相关[7-8]。蜂花粉微观结构的改变,将导致生物活性成分含量出现显著变化[9]。酚酸化合物是蜂花粉中一种重要的生物活性成分,具有抗氧化、抗炎、抑菌等多种活性功能[10-12],但酚酸化合物性质不稳定,对热敏感,在受热情况下极易发生分解、氧化和脱羟基反应,而不同的干燥条件会影响酚酸化合物活性,进而改变食品的营养品质与商品价值[13];因此,适宜的干燥方式对蜂花粉中酚酸类成分的保护至关重要。目前,不同干燥方式对蜂花粉的酚酸化合物的影响鲜见报道。
因此,本实验研究了自然晾晒、热风干燥、中短波红外干燥、真空冷冻干燥和真空脉动干燥对油菜蜂花粉的干燥动力学、色泽、酚酸含量及抗氧化活性的影响,并通过微观结构观察揭示油菜蜂花粉水分迁移和品质的变化规律,同时分析油菜蜂花粉抗氧化活性、酚酸化合物与色泽间的相关性,最后通过主成分分析和聚类分析探究不同干燥方式间的差异,为油菜蜂花粉干燥加工提供理论依据。
新鲜青海油菜蜂花粉(纯度为(85.52±0.64)%))采自青海省西宁市蜂场。
绿原酸、对香豆酸、芥子酸、香草酸、没食子酸标准品(纯度>95%) 上海源叶生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯) 美国赛默飞世尔科技有限公司;水溶性VE(Trolox)标液(纯度>97%)、二硫苏糖醇(纯度>98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、FeSO4·7H2O(纯度>99%) 西格玛奥德里奇贸易有限公司;铁离子还原力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)工作液、无水醋酸钠、冰醋酸、盐酸、FeCl3国药集团化学试剂有限公司。
真空脉动干燥机、冷冻干燥机、热风干燥机 中国农业大学工学院农产品加工技术与装备实验室;中短波红外干燥机 泰州圣泰红外科技有限公司;1290 Infinty II液相色谱系统、6495三重四极杆液相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司;S-3400扫描电子显微镜 日本日立公司;CM-5型分光测色计 日本柯尼卡美能达公司;TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;AR3130电子分析天平 美国OHAUS公司。
1.3.1 含水率的测定和油菜蜂花粉的不同干燥处理
实验前将新鲜油菜蜂花粉放入-20 ℃冰柜中冷冻保存,备用。参考文献[7]测定初始油菜蜂花粉含水率。
分别采用自然晾晒、热风干燥、中短波红外干燥、真空脉动干燥和真空冷冻干燥对油菜蜂花粉进行干燥。当油菜蜂花粉恒质量(前后2 次称量的质量相差小于2 mg)时结束干燥。干燥结束后将油菜蜂花粉取出,冷却至室温后密封,于-20 ℃冰柜中冷冻保存,备用。干燥实验重复3 次。5 种干燥方式的干燥工艺参数设置如下。
自然晾晒(sun drying,SD):在晴朗天气下(温度32 ℃、相对湿度68%),将收集的新鲜油菜蜂花粉直接置于阳光下晒干,铺料厚度为5 mm。晾晒时间为10∶00~16∶00。然后将油菜蜂花粉密封,暂存于干燥器中。
真空脉动干燥[6](pulsed vacuum drying,PVD):辐射板面温度45 ℃;真空保持时间12 min(常压保持时间3 min、铺料厚度5 mm)。
热风干燥[7](hot air drying,HAD):温度45 ℃、风速3 m/s、铺料厚度5 mm。
真空冷冻干燥[14](freeze drying,FD):-40 ℃预冷冻16 h;于25 ℃、50 Pa条件下干燥,铺料厚度为5 mm。
中短波红外干燥[15](infrared drying,IRD):温度45 ℃、功率1 kW、铺料厚度5 mm。
1.3.2 干燥特性分析
各组油菜蜂花粉在干燥处理过程中每隔20 min取样,参考文献[7]测定干基含水率。按式(1)计算油菜蜂花粉的水分比(moisture ratio,MR)[16],记录油菜蜂花粉的MR随干燥时间t/min的变化情况,并绘制出干燥动力学曲线。
式中:M0和Mt分别表示物料初始干基含水率和干燥t时刻的干基含水率/(g/g)。
1.3.3 色泽的测定
色泽测定参考Guclu等[17]的方法,并稍作修改。将油菜蜂花粉分别填满培养皿(直径为45.3 mm,高度为17.3 mm)中,采用CM-5型分光测色计,经白色反射板校正后测定油菜蜂花粉色度:L*值(亮度)、a*值(红度)、b*值(黄度)。按式(2)计算各组油菜蜂花粉的色差ΔE。
式中:L*、a*、b*值分别为经干燥处理油菜蜂花粉的亮度、红度、黄度;L0*、a0*、b0*值分别为新鲜油菜蜂花粉的亮度、红度、黄度。
1.3.4 微观结构观察
待所有干燥实验完成后,7 d内完成微观结构观察。取少量经干燥处理后的油菜蜂花粉固定在铝制载物板上喷金,将制备好的样品放入样品室中,抽真空后使用S-3400型扫描电子显微镜在10 kV的加速电压下观察样品的微观结构,同时将新鲜油菜蜂花粉的微观结构作为对照。
1.3.5 酚酸化合物的液相色谱-质谱联用分析
1.3.5.1 样品前处理
称取(1.00±0.05)g磨碎的待测油菜蜂花粉样品,加入10 mL 80%(体积分数)甲醇溶液;65 ℃水浴加热10 min,漩涡振荡提取2 min,超声5 min;25 ℃、9 000 r/min条件下离心10 min,用0.2 μm尼龙过滤膜过滤后置于棕色进样瓶备用。
混合标准溶液的配制:准确称取1.0 mg的绿原酸、对香豆酸、芥子酸、香草酸、没食子酸标准品,分别加入1 mL甲醇充分溶解,于-20 ℃保存备用。使用前将各标准品配制成混合标准品溶液。
1.3.5.2 液相色谱-质谱联用分析
色谱条件:色谱柱:Poroshell 120 SB-Aq(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);进样量:2.00 μL;柱温:30 ℃;其中,流动相分别为0.1%(体积分数)甲酸溶液(A相)和乙腈(B相),梯度洗脱程序为0.00~0.50 min,5% B;0.51~5.00 min,5%~95% B;5.01~7.00 min,95% B;7.01~8.00 min,5% B;流速:0.300 mL/min。电离模式:负离子模式;雾化压力:45 psi;干燥气(N2):15 L/min,250 ℃;鞘流气(N2):12 L/min,350 ℃;毛细管电压:3 000 V;喷嘴电压:1 500 V;采集模式:多反应监测。
1.3.6 抗氧化能力的测定
1.3.6.1 油菜蜂花粉提取液的制备
样品前处理方法参考Wang Hui等[9]的方法,稍作修改。将油菜蜂花粉粉碎,过60 目筛后称取(2.00±0.05)g油菜蜂花粉于研钵中,加入13 mL体积分数70%的甲醇溶液,充分研磨,转移至50 mL离心管,然后于室温下超声辅助提取30 min,对提取液进行低温离心(4 ℃、8 000 r/min,15 min),收集上清液即油菜蜂花粉提取液,置于4 ℃保存,每个样品重复提取3 次。
1.3.6.2 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基清除能力根据Uribe等[18]的方法进行测定,并稍作修改。取油菜蜂花粉提取液2 mL于具塞管中,加入0.10 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL,在室温下避光保存30 min。使用紫外-可见分光光度计于517 nm波长处测定吸光度。标准曲线:y=-0.015 1x+0.774 8(R2=0.994 8),其中y为吸光度,x为Trolox浓度/(μmol/L)。油菜蜂花粉的DPPH自由基清除能力结果用Trolox当量表示,单位为mmol/g。
1.3.6.3 铁离子还原力
FRAP参考Deng Lizhen等[19]的方法测定,并稍作修改。取3 mL FRAP工作液加入盛有0.1 mL油菜蜂花粉提取液的离心管中,放置10 min后用紫外-可见分光光度计于593 nm波长处测定吸光度。标准曲线:y=0.002 4x+0.043 7(R²=0.999 6),其中y为吸光度,x为Trolox浓度/(μmol/L)。FRAP结果用Trolox当量表示,单位为mmol/g。
采用SPSS 22.0及Origin 2021软件进行数据处理与分析。所有实验均重复3 次,实验结果以平均值±标准差表示。采用Waller-Duncan事后检验对数据进行显著性分析,当P<0.05时表示差异显著。采用Pearson法进行相关性分析。
经测定,油菜蜂花粉的初始湿基含水率为(0.191 7±0.001 6)g/g。不同干燥方式处理油菜蜂花粉MR随干燥时间变化的曲线如图1所示。在干燥前期,干燥MR快速下降;随着干燥时间的延长,油菜蜂花粉干燥MR逐渐下降,最终趋于恒定。由于干燥后期油菜蜂花粉中大部分自由水散失,水分含量越来越接近其平衡含水率,水分扩散速度明显降低。对比5 种干燥方式,中短波红外干燥速率最快,这是因为中短波红外干燥具有速热特性,中短波红外辐射能够穿透物料表层,且能量直接与物料内部的水分耦合,促进物料内部的不易流动水向自由水转化,进而加快水分向外扩散迁移[20-23]。中短波红外干燥油菜蜂花粉微观结构结果发现,中短波红外辐射速热效应使油菜蜂花粉内部的水蒸气分压快速增加,导致其细胞表面破裂,促进细胞内部水分扩散。El-Mesery等[21]在研究苹果片干燥中也发现,相比热风干燥,红外干燥显示出更快的干燥速率。自然晾晒是一种简单而廉价的方法,但干燥耗时长,在室外环境中容易受到虫害和微生物污染。微观结构结果发现,自然晾晒下油菜蜂花粉颗粒表面有微生物聚集。这可能是由于油菜蜂花粉营养丰富、干燥初期水分含量较高,同时长时间暴露在空气中导致微生物迅速增殖。顾赛麒等[24]在研究自然晾晒干制腌腊鱼中也发现,随着晾晒时间延长菌落总数不断增加。与中短波红外干燥相比,低温(45 ℃)真空脉动干燥油菜蜂花粉微观结构具有更好的完整性,这与本课题组前期研究结果[6]一致。
图1 不同干燥方式油菜蜂花粉MR变化曲线及微观结构Fig.1 Moisture ratio curves and microstructure of rape bee pollen subjected to different drying methods
不同干燥方式处理的油菜蜂花粉亮度(L*值)、红度(a*值)、黄度(b*值)和色差(ΔE)如表1所示。研究表明,色差ΔE大于5时,即使没有经验的观察者也可以通过人眼识别颜色差异[9]。由于采用较优干燥工艺参数,5 种干燥方式ΔE均小于5,因此感官评价未见差异。与新鲜油菜蜂花粉相比,真空脉动干燥油菜蜂花粉L*值与b*值变化不显著(P>0.05),a*值显著降低(P<0.05),ΔE最小(0.98±0.04),表明真空脉动干燥能有效地阴止油菜蜂花粉的色泽劣变,这与钱婧雅等[25]对红枣脆片干燥的研究结果一致。其他4 种干燥处理的油菜蜂花粉的L*值均显著降低(P<0.05),干燥处理后的油菜蜂花粉色泽均变暗,这可能是由于蜂花粉在干燥过程中的表面收缩会导致花粉颗粒向内折叠,从而导致反射光线的减少,L*值降低[26]。自然晾晒油菜蜂花粉a*值最高,ΔE最高(3.22±0.05)。其较低的干燥速率和较长的热暴露时间会导致色素降解和非酶褐变的发生,从而发生较严重的色泽劣变[27-28]。
表1 不同干燥方式对油菜蜂花粉色泽的影响Table 1 Effects of different drying methods on color parameters of rape bee pollen
酚酸是植物次生代谢产物中含有羧酸官能团的芳香族酚类物质,是蜂花粉中重要的生物活性物质之一[1,29]。如表2所示,油菜蜂花粉中共测得没食子酸、香草酸、绿原酸、对香豆酸、芥子酸5 种酚酸,与新鲜油菜蜂花粉相比,干燥后酚酸总量显著增加(P<0.05)。油菜蜂花粉中的酚酸主要为对香豆酸,约占新鲜油菜蜂花粉酚酸总量的80%。与新鲜油菜蜂花粉相比,干燥后花粉中对香豆酸含量变化不明显,没食子酸含量增加,绿原酸、香草酸和芥子酸含量显著增加(P<0.05)。研究表明,当温度超过70 ℃时,酚酸会受热降解[30],因此较低的干燥温度(≤45 ℃)能较好地保护油菜蜂花粉中的酚酸化合物。真空脉动干燥油菜蜂花粉对香豆酸含量最高,为(7 877.90±556.48)mg/kg,且显著高于冷冻干燥和自然晾晒的油菜蜂花粉。这是因为在真空脉动干燥过程中,干燥室的压力在真空与常压之间交替循环,使物料内部形成孔道,有利于提高细胞内部物质的提取率[31]。此外,真空脉动干燥可抑制酶促褐变、氧化等不良生化反应的发生,从而抑制了酚酸等生物活性物质的降解[32]。与其他油菜蜂花粉相比,自然晾晒油菜蜂花粉中香草酸和没食子酸含量最高,比新鲜油菜蜂花粉分别提高了2.88 倍和2.07 倍。这是由于自然晾晒适宜微生物繁殖,相关研究表明微生物会合成包括酚酸在内的植物多酚[33],可能造成了以香草酸为主的酚酸含量显著增加。与新鲜油菜蜂花粉相比,中短波红外干燥花粉中没食子酸、绿原酸、香草酸和芥子酸的含量显著增加(P<0.05),这是由于中短波红外干燥导致花粉细胞结构的破坏(图1B),有利于细胞内部酚类化合物的释放,从而提高酚类化合物的提取率[34]。与新鲜油菜蜂花粉相比,5 种方式干燥处理组样品的绿原酸含量均显著提高(P<0.05),这可能是植物在受到脱水等非生物胁迫时,会通过生成酚类化合物作为防御机制响应胁迫,其中包括生成以绿原酸为代表的苯丙类化合物[35-36]。
表2 干燥方式对油菜蜂花粉酚酸含量的影响Table 2 Effects of drying methods on the contents of phenolic acids in rape bee pollen
干燥方式对油菜蜂花粉抗氧化活性的影响如图2所示,5 种干燥方式处理的油菜蜂花粉FRAP与新鲜油菜蜂花粉相比均显著增加(P<0.05)。其中,真空脉动干燥油菜蜂花粉FRAP最强,FRAP为(1 961.11±4.42)mmol/g,比新鲜油菜蜂花粉提高了24.78%。干燥后油菜蜂花粉FRAP显著提高,这是由于热处理可能会破坏共价键,使细胞释放出黄酮类、酚酸化合物和类胡萝卜素等抗氧化剂[37]。
图2 干燥方式对油菜蜂花粉抗氧化能力的影响Fig.2 Effects of drying methods on antioxidant activity of rape bee pollen
5 种干燥方式处理的油菜蜂花粉清除DPPH自由基的能力差异不显著。相关研究表明酚酸的抗氧化活性随着其羟基化程度的增加而增加[38]。而对香豆酸和香草酸作为油菜蜂花粉中主要的酚酸,它们的羟基化程度不高,均只有一个羟基,因此对香豆酸与香草酸在DPPH自由基溶液中给电子能力较弱,显示出低的DPPH自由基清除能力,可能导致5 种干燥方式下油菜蜂花粉的DPPH自由基清除能力差异不显著。其中,冷冻干燥的DPPH自由基清除能力最低(163.71±23.73)mmol/g,这可能是由于冷冻干燥处理过程中没有高温诱导引起的化学反应,酚类物质在反应过程中产生的各种衍生物有限,不能对DPPH自由基表现出更强的清除能力[13]。因此,油菜蜂花粉复杂的组分和抗氧化活性作用机理的不同导致了FRAP和DPPH自由基清除能力的差别。研究结果表明FRAP法可能更适合评价油菜蜂花粉的抗氧化活性。
基于酚酸化合物含量、色泽和抗氧化活性的实验结果,对5 种不同干燥方式处理的油菜蜂花粉样品进行主成分分析,观察不同干燥方式下样品的分布。主成分分析的得分图和荷载图如图3所示,第一主成分(PC1)方差贡献率为51.2%,第二主成分(PC2)方差贡献率为23.6%,累积方差贡献率达到74.8%。如图3A所示,5 种干燥方式的样品分别位于PCA得分图的4 个象限。中短波红外干燥蜂花粉位于PC1和PC2的分隔线上,热风干燥蜂花粉分布于第二象限。热风干燥与中短波红外干燥有较好的聚集性,说明这两种干燥方式下的油菜蜂花粉品质接近。自然晾晒样品位于第一象限,真空脉动干燥样品位于第二象限,除了一个冷冻干燥样品外,大多数冷冻干燥样品位于第三象限。结合酚酸化合物含量、色泽和抗氧化活性的实验结果可知,真空脉动干燥油菜蜂花粉FRAP最强,L*值和对香豆酸含量较高,故真空脉动干燥样品分布于PC2正向;自然晾晒油菜蜂花粉总色差较大,没食子酸、香草酸、芥子酸含量较高,故自然晾晒样品分布于PC1、PC2正向;冷冻干燥油菜蜂花粉绿原酸含量最高,故冷冻干燥样品分布于PC2负向。综上,结合色泽、酚酸含量和抗氧化活性进行主成分分析能较好地区分不同干燥方式处理的油菜蜂花粉样品。
图3 不同干燥方式的PCA得分图(A)和荷载图(B)Fig.3 PCA score plot (A) and loading plot (B) for discrimination of different drying methods
为了验证主成分分析的结果,采用系统聚类法计算5 种不同干燥方式处理的油菜蜂花粉样品之间的相似度。聚类分析结果如图4所示,5 种不同干燥方式被分为3 类:第一类为真空脉动干燥、热风干燥和中短波红外干燥;第二类为冷冻干燥;第三类为自然晾晒。其中自然晾晒与其他4 种干燥方式差异最大,相似度为0;冷冻干燥与真空脉动干燥、热风干燥和中短波红外干燥的相似度为47.84%,这是由于冷冻干燥的低温环境与其他3 种热干燥(45 ℃)有较大的区别;真空脉动干燥与热风干燥、中短波红外干燥相似度为61.83%,这是因为真空脉动干燥为变压(常压和负压脉动循环)干燥,而热风干燥与中短波红外干燥为常压干燥;热风干燥与中短波红外干燥这两种干燥方式之间由于干燥温度相同,并且均为常压干燥,故相似度较高,达84.11%。聚类分析结果与主成分分析结果相似,同时也综合体现了5 种干燥方式之间的差异性。
图4 不同干燥方式的聚类分析Fig.4 Clustering analysis of different drying methods
采用皮尔森双尾检验,对5 种干燥方式处理下的干燥油菜蜂花粉样品的酚酸化合物含量、色泽参数和抗氧化活性进行相关性分析。相关性分析结果如图5所示。其中酚酸化合物含量之间存在相关性,芥子酸、没食子酸含量分别与香草酸含量呈极显著正相关(P<0.01)。油菜蜂花粉在干燥后的色泽变化与酚酸化合物含量有关。没食子酸含量与油菜蜂花粉总色差显著正相关(P<0.05),香草酸含量与总色差极显著正相关(P<0.01);没食子酸、香草酸含量与L*值极显著负相关(P<0.01),与b*值显著负相关(P<0.05);对香豆酸含量与总色差显著负相关,与L*值显著正相关(P<0.05);芥子酸含量与a*值极显著负相关(P<0.05);没食子酸、香草酸含量与b*值呈显著负相关(P<0.05)。但是,DPPH法和FRAP法测定的抗氧化活性与酚酸化合物之间在统计学上无显著的相关性(P>0.05),这可能是由于除酚酸之外,干燥过程中生成的美拉德反应产物可提高抗氧化活性[34]。此外,Imeh等[39]在不同品种的苹果和梨的研究中发现,除了多酚以外的其他因素(如β-胡萝卜素)也有助于提高总抗氧化活性。
图5 不同干燥方式处理下油菜蜂花粉色泽、酚酸化合物含量及抗氧化活性的相关系数热图Fig.5 Heatmap for Pearson’s correlation coefficients between color,phenolic acid contents and antioxidant activity of rape bee pollen subjected to different drying methods
本实验探究了不同干燥方式对油菜蜂花粉的干燥动力学、色泽、酚酸化合物含量、抗氧化活性和微观结构的影响。中短波红外干燥导致其细胞表面破裂,促进细胞内部水分扩散;自然晾晒耗时最长,色泽劣变最严重,并且干燥过程导致油菜蜂花粉受到了微生物污染;真空脉动干燥油菜蜂花粉色泽保持最好,与所有其他干燥样品相比,真空脉动干燥处理的油菜蜂花粉FRAP显著增加(P<0.05)。与新鲜油菜蜂花粉相比,所有干燥方式处理下的油菜蜂花粉的没食子酸含量增加,绿原酸、香草酸和芥子酸含量显著增加(P<0.05)。通过对色泽、酚酸含量和抗氧化活性进行主成分和聚类分析,较好地区分了不同干燥方式处理的油菜蜂花粉样品。相关性分析结果显示,香草酸含量分别与芥子酸含量和没食子酸含量呈极显著正相关(P<0.01);对香豆酸含量与总色差显著负相关,而与L*值显著正相关(P<0.05)。本研究为蜂花粉干燥工艺的选择及品质调控提供了理论依据和实验参考。