半乳糖基甘油糖脂对蜡样芽胞杆菌的抑菌活性及其构效关系

姚孟佳,刘冬芹,王颖,陆兆新,吕凤霞,赵海珍

(南京农业大学食品科学与技术学院,江苏 南京 210095)

蜡样芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一种G+、兼性厌氧、能形成芽胞的条件性致病菌[1],在环境中无处不在,可以从土壤、沉积物、水以及谷物、牛奶、香料、水果和蔬菜等不同类型的食物中分离出来[2]。蜡样芽胞杆菌可产生多种毒素,其中不耐热肠毒素和致吐毒素(Cereulide)最易引起食物中毒,主要包括呕吐型和腹泻型。虽然不耐热肠毒素可以通过加热使其失去毒性,但Cereulide却很难通过热处理灭活[3]。国家食源性疾病监测网对中国食源性疾病暴发的监测资料显示,由蜡样芽胞杆菌引起的疾病占所有微生物食源病例的8.6%[4];2018年随机采集的福建省126份外卖配送餐中,蜡样芽胞杆菌总检出率达20.6%,存在一定的卫生安全隐患[5]。因此,对蜡样芽胞杆菌的防控还需引起高度的重视。

甘油糖脂(glyceroglycolipid)是由亲水性的糖基和亲脂性的酰基甘油通过α-或β-糖苷键连接起来的一类重要的糖复合物,是植物、细菌,尤其是革兰氏阳性菌双层膜结构中的常见组成成分。单半乳糖基二酰甘油(MGDG)、双半乳糖基二酰甘油(DGDG)和磺基喹诺酮糖基二酰甘油(SQDG)是光合作用所必需的光合膜中3种主要的甘油糖脂[6-7]。甘油糖脂是一种非离子型表面活性剂,它的两亲性结构使其具有多种生物活性。Degraeve-Guilbault等[8]研究表明SQDG能抑制肿瘤细胞的生长,是一种有效的DNA聚合酶抑制剂;蒋志国等[9]从南瓜中分离得到多种半乳糖基甘油糖脂,并发现其抗炎能力显著;Pongmuangmul等[10]从鳄嘴花叶片中提取了MGDG和DGDG,在临床试验中成功用于治疗皮肤炎症、蚊虫叮咬及水痘状疱疹等病变,并且能抑制单纯疱疹病毒(HSV)的活性;Nakata等[11]从微杆菌中提取到MGDG,发现其具有明显的抗氧化活性,能够减少加热和外部的H2O2引起的细胞死亡;Ahamed等[12]从颤藻中分离出MGDG,发现其抑菌效果优于抗生素头孢吡肟。因此,甘油糖脂可作为食品防腐剂用于食品防腐保鲜中,也可进一步开发为抗肿瘤等药物,还可利用它的两亲性将其用于化妆品、洗涤等行业,在医药、食品防腐、日化等领域有着广泛的应用前景。

本课题组前期研究了部分半乳糖基甘油糖脂的抗肿瘤、抑菌等生物活性[13-14],以及半乳糖基月桂酸甘油单酯的抑菌机制[15-16]。本试验通过研究一系列含有不同脂肪酸链数量及长度(C8∶0— C18∶3)的半乳糖基甘油糖脂对不同蜡样芽胞杆菌菌株的抑菌活性,初步探讨其结构与抑菌活性之间的关系,旨在为深入研究半乳糖基甘油糖脂的构效关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5株蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus):CMCC 63301、ATCC 33019、ATCC 14579、ATCC 4342、ATCC 10987,购买于上海北诺生物科技有限公司,由南京农业大学食品科学与技术学院酶工程实验室保存。半乳糖基甘油(纯度>95%)、半乳糖基甘油糖脂(纯度>90%)均由本实验室自制。LB培养基:酵母膏5.0 g,氯化钠10.0 g,胰蛋白胨10.0 g,去离子水1 L,pH7.0,121 ℃灭菌20 min。

1.2 主要仪器与设备

SX-700高压蒸汽灭菌器购自日本TOMY公司;Orion 3 STAR pH计购自美国Thermo公司;SW-CJ-IBU超净工作台购自苏州净化设备有限公司;HYL-A全温摇瓶柜购自太仓市强乐实验设备厂;UV-2450紫外分光光度计购自日本岛津公司;VarioskanTM多功能酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 半乳糖基甘油糖脂的制备1)半乳糖基甘油的制备:采用Wei等[17]的方法制备半乳糖基甘油。2)半乳糖基甘油糖脂的制备:采用齐丹萍等[18]的方法并稍作修改。以半乳糖基甘油和9种游离脂肪酸(辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸)为底物,以固定化脂肪酶Novozyme 435为催化剂,通过酶促反应合成不同结构的半乳糖基甘油糖脂,再通过硅胶柱层析,分离纯化得到18种半乳糖基甘油糖脂;利用薄层色谱(TLC)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)、质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)等方法对半乳糖基甘油糖脂进行分析鉴定。用甲醇将半乳糖基甘油糖脂溶解,并用0.22 μm有机滤膜过滤除菌,制备不同浓度的半乳糖基甘油糖脂样品溶液以备后续抑菌试验使用。

1.3.2 菌悬液的制备将实验室保存的5株蜡样芽胞杆菌(CMCC 63301、ATCC 33019、ATCC 14579、ATCC 4342、ATCC 10987)分别接种到100 mL的LB液体培养基中,37 ℃、180 r·min-1条件下培养12 h后,吸取1 mL菌液到新鲜的LB液体培养基中,在相同条件下再培养12 h,得到初始菌液。采用血球计数法和分光光度法相结合的方法,将初始菌液稀释成106～107CFU·mL-1的菌悬液。

1.3.3 抑菌活性的测定采用Atsamnia等[19]的方法并稍作修改。以5株蜡样芽胞杆菌为指示菌,采用打孔法测定18种半乳糖基甘油糖脂的抑菌圈直径。将稀释好的菌液均匀涂布在LB固体培养基表面,用直径为6 mm的无菌打孔器打孔,向各孔内分别加入5 mg·mL-1半乳糖基甘油糖脂溶液50 μL,以甲醇溶液为对照,置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h,用卡尺测量抑菌圈直径。试验平行3次,取其平均值。

1.3.4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定以5株蜡样芽胞杆菌为指示菌,采用傅瑞春等[20]的方法测定18种半乳糖基甘油糖脂的MIC和MBC。

1.3.5 抑菌率的测定用菌落计数法计算平板上的菌落数,并按照以下公式计算半乳糖基甘油糖脂对蜡样芽胞杆菌的抑菌率:

抑菌率=(阳性对照菌落数-MIC浓度的菌落数)/阳性对照菌落数×100%。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2010软件进行数据统计与整理,采用SPSS 22.0软件进行显著性检验和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 半乳糖基甘油糖脂的分子结构

通过硅胶柱层析法分离纯化得到18种半乳糖基甘油糖脂,经质谱及核磁共振波谱分析鉴定,具体结构见图1和表1。

图1 半乳糖基甘油糖脂分子结构的基本骨架Fig.1 Basic skeleton of galactosylglyceride structure

表1 18种半乳糖基甘油糖脂分子中R1、R2的结构简式Table 1 Structural formula of R1 and R2 in 18 galactosylglycerides

2.2 半乳糖基甘油糖脂对蜡样芽胞杆菌的抑菌活性

由表2可见:半乳糖基肉豆蔻酸甘油单酯(7号)的抑菌圈直径最大,对5株蜡样芽胞杆菌的抑菌效果最好,直径均达16～20 mm,属于高度敏感;其次是肉豆蔻酰化半乳糖基肉豆蔻酸甘油单酯(8号)和半乳糖基月桂酸甘油糖脂(5、6号),它们对5株蜡样芽胞杆菌的抑菌效果也较好,直径均在中度敏感的11～15 mm;接着是半乳糖基癸酸甘油糖脂(3、4号)、半乳糖基辛酸甘油糖脂(1、2号)以及含不饱和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂(13～18号),它们对5株蜡样芽胞杆菌的抑菌效果稍有差别,在6～10 mm或11～15 mm范围内;抑菌效果较差的是含有长链饱和脂肪酸的半乳糖基棕榈酸甘油糖脂(9、10号)和半乳糖基硬脂酸甘油糖脂(11、12号),它们对5株蜡样芽胞杆菌只是低度敏感或几乎没有抑菌效果。

表2 半乳糖基甘油糖脂对5株蜡样芽胞杆菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of galactosylglycerides against five strains of Bacillus cereus

2.3 半乳糖基甘油糖脂对蜡样芽胞杆菌的最小抑菌浓度

由表3可见:7号对5株蜡样芽胞杆菌的MIC值均为0.039 mg·mL-1,抑菌效果最好;5号对5株蜡样芽胞杆菌的MIC值均为0.078 mg·mL-1;6号和8号的MIC值为0.078 mg·mL-1或0.156 mg·mL-1;1～4号以及13～18号对5个菌株的MIC值为0.313～5.000 mg·mL-1;9～12号抑菌效果较差。半乳糖基甘油糖脂的MIC结果与抑菌圈试验结果基本吻合。

表3 半乳糖基甘油糖脂对5株蜡样芽胞杆菌的最小抑菌浓度Table 3 Minimum inhibitory concentrations(MIC)of galactosylglycerides against five strains of B. cereus mg·mL-1

2.4 半乳糖基甘油糖脂对蜡样芽胞杆菌的最小杀菌浓度

由表4可见:7号对5株蜡样芽胞杆菌的MBC值均为0.039 mg·mL-1,与MIC值相同,说明其对蜡样芽胞杆菌的杀菌效果相当好;5号和6号的MBC值大于其MIC值,杀菌效果不如8号;1～4号以及13～18号对5个菌株的MBC值为0.625～5.000 mg·mL-1;9～12号对5个菌株的MBC值为5.000～20.000 mg·mL-1或大于20.000 mg·mL-1,抑菌活性较低。

表4 半乳糖基甘油糖脂对5株蜡样芽胞杆菌的最小杀菌浓度Table 4 Minimum bactericidal concentration(MBC)of galactosylglycerides against five strains of B. cereus mg·mL-1

2.5 半乳糖基甘油糖脂对蜡样芽胞杆菌的抑制作用

由表5可见:7号的抑菌率最高,然后是8号,两者对5株蜡样芽胞杆菌的抑菌率均在99%以上;之后是5和6号,对5株菌的抑菌率均在97%以上;1～4号以及13～18号对5株菌的抑菌率也都在96%以上;虽然9～12号的抑菌效果较差,但其抑菌率也均在95%以上。9～12号对5株蜡样芽胞杆菌抑菌率的差异比较大,例如9号对菌株ACTT 4342完全没有抑制作用,但对其他4株菌的抑菌率均在95%以上;10号对CMCC 63301和ATCC 33019这2株菌表现出较高的抑菌率,对其他3株菌却没有抑制作用。同一物质对不同蜡样芽胞杆菌菌株表现出的抑菌率差异如此之大,其中原因需要进一步的试验去探究。

表5 半乳糖基甘油糖脂对5株蜡样芽胞杆菌的抑菌率Table 5 Inhibition rate of galactosylglycerides against five strains of B. cereus %

2.6 半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性与其结构因素间的相关性

相关性分析结果表明,半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性与其所含脂肪酸链的不饱和度呈极显著负相关(r=-0.564,P<0.01),与其所含脂肪酸链的长度不是简单的线性关系(P>0.05),而是存在截断(cut-off)效应。随着脂肪酸链长从C8增加到C14,半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性增加,而脂肪酸链长进一步增加至C16和C18,则会减弱其抑菌活性。

3 讨论与结论

本试验结果表明,半乳糖基肉豆蔻酸甘油单酯在18种半乳糖基甘油糖脂中的抑菌活性最强,其对5株蜡样芽胞杆菌的MIC和MBC值均为0.039 mg·mL-1,抑菌率均在99%以上;其余结构的半乳糖基甘油糖脂也分别具有一定的抑菌活性。Ahamed等[12]研究发现MGDG能抑制大肠杆菌等产生超广谱β-内酰胺酶的细菌生长,且MIC值为0.1 mg·mL-1;Diao等[16]研究发现半乳糖基月桂酸甘油单酯对蜡样芽胞杆菌的MIC值为0.156 mg·mL-1。虽然目前关于半乳糖基甘油糖脂应用的相关报道较少,但已有的研究结果均表明其有良好的抑菌活性。因此,半乳糖基甘油糖脂可作为一种具有发展潜力的生物抗菌剂。

本研究中,含有中链脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的抑菌效果好;半乳糖基甘油单酯的抑菌活性与酰化半乳糖基甘油单酯的抑菌活性之间存在差别;在含有长链脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂中,含有不饱和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性高于含有饱和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂。Colombo等[21]发现脂肪酸链的长度影响半乳糖基甘油单酯的活性。本试验中半乳糖基甘油糖脂的脂肪酸链长度影响其抑菌活性的结果与之相一致。Ferrer等[22]发现麦芽糖月桂酸单酯对芽胞杆菌有良好的抑菌活性,而麦芽糖月桂酸二酯则无明显的抑菌效果。本试验中半乳糖基甘油单酯的抑菌活性大多高于酰化半乳糖基甘油单酯的结果与之相一致,说明半乳糖基甘油糖脂中脂肪酸链的数量不同,会使其抑菌活性产生差异。Colombo等[23]研究发现,含有不饱和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的抗肿瘤活性强于含有饱和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的活性。本试验中含有不饱和脂肪酸(C18∶1— C18∶3)的半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性高于含有饱和脂肪酸(C18∶0)的半乳糖基甘油糖脂的结果与之相同,表明脂肪酸链长度相同但饱和度不同,同样会影响半乳糖基甘油糖脂的活性。Ahamed等[12]研究发现,半乳糖基棕榈酸甘油二酯对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的MIC值和MBC值均为0.1 mg·mL-1。而本试验合成的酰化半乳糖基棕榈酸甘油单酯对蜡样芽胞杆菌(革兰氏阳性菌)的MBC值远大于0.1 mg·mL-1,表明即使脂肪酸链组成和数目相同,但脂肪酸链的分布位置不同也会导致半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性甚至抑菌谱发生很大的改变。Sørensen等[24]发现不同链长阿魏酸烷基酯的抗氧化活性与烷基链长之间存在截断效应。本研究也发现半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性与其所含脂肪酸链的长度之间存在截断效应,说明脂肪酸链长对半乳糖基甘油糖脂抑菌活性的影响比较复杂。

不同结构的半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性不同,可能与其自身的疏水作用、立体结构等有关。张希等[25]利用定量构效关系(QSAR)方法研究了甘油单酯对蜡样芽胞杆菌的抑菌活性与其结构之间的构效关系,结果发现,直线型脂肪酸链的C12或C13区域周围存在大体积结构,而碳链大于C14区域周围不存在大体积结构时,可以增强甘油单酯的抑菌活性。本试验结果表明,半乳糖基甘油糖脂所含脂肪酸链的长度、数量以及不饱和度的不同都会影响其抑菌活性,原因可能是不同结构的半乳糖基甘油糖脂具有不同的亲、疏水性和空间结构等分子特性。下一步将利用QSAR方法对半乳糖基甘油糖脂的结构与其抑菌活性的定量构效关系进行详细研究。