矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对人原代成骨细胞JNK/ FOXO1的影响

陈 琳 胡博森 周 波 陈 拥

1.沈阳医学院公共卫生学院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳医学院附属中心医院骨科，辽宁沈阳 110024

骨质疏松症是常见的慢性病，伴有骨量及微结构系统性损伤，易引发脆性骨折。21 世纪以来，随着老龄化加剧，慢性病发病率逐年升高。骨质疏松症等慢性病已是全球性公共卫生问题[1]。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）是花色苷最常见的形式[2-3]，因其具有抗氧化的作用，可对多种慢性病的防治产生积极效应，如糖尿病[4]、癌症[5]、神经系统疾病[6]和心血管疾病[7]等。研究显示[8-10]，花色苷可减缓骨质流失。亦有研究发现，C3G 能促进成骨细胞增殖分化，但机制尚未明确[11]。叉头盒蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）是成骨过程中的氧化调节因子，与成骨细胞活性关系密切[12]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun Nterminal kinase，JNK）通路与骨质疏松有关，但调节方向不明。有研究显示，JNK/FOXO1 与氧化应激及成骨细胞增殖和分化有关[12-14]。本研究将探讨C3G 对人原代成骨细胞JNK/FOXO1的影响，及对转录激活因子-4（activiating transcripition factor-4，ATF4）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）mRNA 表达水平的影响，对以C3G 为主成分的骨质疏松类保健品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

C3G（大连美仑生物技术有限公司，纯度>98%，批号：7084-24-4）；MTT 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：G020-1-1）；Trizol 试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司，批号：9108、RR037A、RR820A）。

细胞培养箱（BB-15，Thermo Fisher Scientific）；酶标仪（SpectraMax Plus 384，Moleclar Devices）；核酸分析仪（Nano，Thermo Fisher Scientific）；实时荧光定量PCR 仪（7500FAST，ABI）。

1.2 实验方法

1.2.1 人原代成骨细胞的分离与培养

本研究方案经学校伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书。收集2017 年6 月至2018 年6 月沈阳医学院附属中心医院60～90 周岁的骨质疏松且股骨颈或股骨粗隆间骨折行人工股骨头或全髋置换患者的松质骨组织。将其剪碎至直径约3 mm，PBS 冲洗后，加入红细胞裂解液。室温条件下充分混匀。随后，弃裂解液，加胰蛋白酶，再加入双酶消化液。离心取沉淀即为人原代成骨细胞。将细胞沉淀重悬，移至培养瓶中（α-MEM 细胞培养液含有10% FBS），37℃、5%CO2培养箱中培养，每4 天换液1 次，细胞1∶2 传代。第三代及以后的细胞可用于后续实验。

1.2.2 MTT 法检测C3G 对人成骨细胞增殖的影响

设置分组：control 组（含0 μmol/L C3G的α-MEM培养液）、C3G 组（含100 μmol/L C3G的α-MEM 培养液）。细胞以4000 个/孔的密度接种于96 孔板，各组经无血清同步化处理24 h 后加入各处理因素。24 h后使用MTT 法分析成骨细胞增殖的情况，按试剂盒说明操作。使用酶标仪在570 nm 处测定吸光度。

1.2.3 实时荧光定量PCR 法检测基因表达

1.2.3.1 C3G 对细胞FOXO1、ATF4 和OPG的基因表达的影响 实验分组同“1.2.2”项下。细胞以1.4×106个/皿接种在10 cm 培养皿中，待细胞贴壁后使用无血清培养基处理24 h，同步化处理后处理各组细胞，继续培养24 h，收集样本。使用Trizol 法抽提细胞总RNA，随后反转录合成cDNA。以GAPDH 基因为内参，2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。使用Primer Blast 设计引物，由上海生工生物公司合成，FOXO1、ATF4 和OPG的引物序列见表1。按TaKaRa 试剂盒要求配置反应混合液：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μl；，RNase-Free ddH2O 0.6 μl，引物预混液1 μl，稀释好的cDNA 8 μl，总体系为20 μl。反应条件为：95℃条件下，预变性2 min，接着40 个循环，95℃、5 s；冷却到60℃、34 s，延伸到68℃、30 s；然后进行PCR 扩增，收集荧光信号，进行熔解曲线分析。

表1 引物序列

1.2.3.2 JNK 信号通路抑制剂和C3G 对细胞FOXO1基因表达的影响 设置分组：SP600125-control 组（含0 μmol/L C3G 和50 μmol/L SP600125的α-MEM 培养液）、SP600125-C3G 组（含100 μmol/L C3G 和50 μmol/L SP600125的α-MEM 培养液）。将细胞密度调节至1.4×106个/皿后接种在10 cm 培养皿中。细胞贴壁后，无血清培养基同步化处理。在同步化处理结束前4 h使用含有50 μmol/L的SP600125 抑制剂的α-MEM培养基对两组细胞进行预孵。待孵育结束后按上述实验分组分别加入相应的干预因素处理细胞，继续培养24 h。用“1.2.3.1”项下方法进行样品总RNA 提取和FOXO1 基因表达检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C3G 对人原代成骨细胞增殖活力的影响

C3G 组人原代成骨细胞增殖率高于control 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见图1。

图1 control 组与C3G 组细胞增殖率比较（n=3）

2.2 C3G 对人原代成骨细胞FOXO1、ATF4 和OPG mRNA 表达水平的影响

C3G 组人原代成骨细胞FOXO1、ATF4、和OPG mRNA 相对表达量低于control 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见图2。

图2 control 组与C3G 组FOXO1、ATF4 和OPG mRNA 表达水平比较（n=3）

2.3 JNK 信号通路抑制剂处理后C3G 对人原代成骨细胞FOXO1 mRNA 表达水平的影响

SP600125-control 组和SP600125-C3G 组FOXO1的mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图3。

图3 SP600125 处理后control 组与C3G 组FOXO1 基因表达量比较（n=3）

3 讨论

骨质疏松实质是骨重塑和吸收异常[15]，而成骨细胞在骨重塑中发挥着重要作用，而氧化应激是其影响因素[16]。C3G 具有抗氧化能力[11,17-19]，在骨代谢中可促进成骨细胞的增殖分化，但未阐明机制。

FOXO1 被证明是骨质量的调节因子，与ATF4 和OPG 等基因联系密切，在成骨细胞中相互影响[21]。ATF4位于FOXO1 通路下游，是关键的转录因子，其表达受FOXO1的调控，FOXO1 与ATF4 相互作用可调节成骨细胞的蛋白合成和氧化应激[22]。FOXO1 基因缺失，常伴随OPG 表达水平降低[23]。Guo 等[24]研究发现，C3G能使脂肪细胞FOXO1的含量下降，从而改善机体的炎症水平。本研究结果显示，C3G 能下调FOXO1、ATF4和OPG的表达，故认为C3G 在成骨细胞中发挥抗氧化抗炎作用与FOXO1 有关。

研究显示，成骨细胞发生氧化应激损伤时，JNK/FOX 信号轴能产生抵抗作用[11]，FOXO1 向核的移动能促进JNK 活化[25]。Yan 等[26]研究发现，以C3G 为主成分的花色苷能消除氧化应激导致的HepG2 细胞p-JNK 和FOXO1 上调。使用JNK 通路的抑制剂SP600125对细胞进行处理后，两组FOXO1 表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。提示当JNK 受到抑制时，C3G的加入不能改变FOXO1的基因表达，C3G 可能通过JNK 通路对人成骨细胞FOXO1 mRNA的表达量产生影响。

综上所述，本研究使用人原代成骨细胞模型，观察C3G 对人原代成骨细胞增殖活力的影响以及对FOXO1、ATF4 和OPG 表达的影响，发现C3G 能促进人原代成骨细胞的增殖，C3G 可以下调人原代成骨细胞中的FOXO1、ATF4 和OPG的基因表达。同时发现C3G 能够通过影响JNK 来进一步影响FOXO1。本研究结果为以C3G 为主成分的骨质疏松类保健品开发提供理依据。由于转录因子调控机制的复杂性及体外实验与实际的体内情况存在差异性，关于C3G影响成骨细胞增殖的具体分子机制仍需要大量实验验证。