基于网络药理学与分子对接探讨水陆二仙丹治疗糖尿病肾病的潜在分子机制

李亚蒙 侯亚威 徐玉坤 李 芮

1.山东中医药大学中医学院，山东济南 250000；2.山东中医药大学附属医院老年医学科，山东济南 250000

水陆二仙丹（金樱子-芡实）出自《洪氏经验方》，金樱子生于山上谓之“仙”，味酸甘涩，性平，固精缩尿；芡实生于水中，味甘涩，性亦平，益肾固精；二者用于治疗男子遗精白浊，女子带下及小便频数、遗尿等症状[1]。

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发病机制尚不完全清楚，但与糖代谢紊乱密切相关，作为最严重的微血管并发症之一，DN 已成为终末期肾病主要发病原因，临床上多采用葡萄糖控制、脂质调节、抗氧化和血管紧张素转换酶抑制剂等措施，但效果不理想[2]。因此运用中西医结合的治疗方式被学者普遍认同，在传统祖国医学中，DN 属于“消渴”“水肿”等范畴，中药能够明显延缓DN的进展，减轻患者痛苦。其中水陆二仙丹是治疗DN的常用处方，并取得良好成效[3]。

现为明确水陆二仙丹治疗DN的具体分子机制，运用网络药理学方法，并进行分子对接验证，明确作用靶点及分子机制，为进一步探索DN的发病机制及开发新的治疗药物提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 药物相关靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库寻找2 味中药化学组成成分，并进行ADME 筛选，按照口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18 两个阈值初步获得药物有效活性成分及其作用的蛋白质靶点，并通过TCMID 及中国知网、万方搜集2015 年1 月至2020 年9 月的文献补充未预测到的靶点，删除未预测到的靶点有效活性成分，将筛选后得到的靶点统一在Uniprot 蛋白质数据库规范化合物作用靶点[4]。

1.2 “药物-活性成分-靶点”网络图构建

将药物活性成分及靶点导入Cytoscape 3.7.2 中，构建“药物-活性成分-靶点”网络图。

1.3 疾病相关靶点的筛选

在GeneCards 数据库中挖掘DN的潜在靶点，该数据库Score 值越高则代表该靶点与疾病关系越密切。根据学者经验，疾病靶点过多，则设为Score≥中位数的目标靶点为DN的潜在靶点，并在TTD 数据库、OMIM 数据库及DRUGBANK 中寻找DN 靶点予以补充，删除4 个数据库的重复值得到DN 靶点。

1.4 维恩图及蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

为明确“药物-疾病”靶点间的相互作用，利用R语言绘制二者维恩图，获得交集靶点。将交集靶点导入STRING11.0 版数据库中进行PPI 分析，获得PPI网络，导出tsv 格式文本，并将其文本导入Cytoscape 3.7.2 中，借助MCODE 插件，对PPI 网络中紧密区域进行提取及可视化[5]。

1.5 药物-疾病靶点功能与通路富集分析

将“1.4”项下交集靶点导入Metascape 平台，物种选择H.Sapiens（70），设置均为默认值，完成其主要的GO 生物学过程及KEGG 信号通路分析，通过生物信息学平台对数据结果进行可视化分析。

1.6 “成分-靶点-通路”网络图的构建

通过Cytoscape 3.7.2 构建“成分-靶点-通路”网络图，对交集的网络进行拓扑分析，包括连接度、介度中心性、紧密度中心性，据此探究水陆二仙丹治疗DN发挥作用的主要成分、靶点及通路。

1.7 分子对接验证

将“1.6”项下主要成分与靶点进行分子对接验证，依据TCMSP 搜索化合物小分子2D 结构，采用Chem-Draw 19.0 绘出此2D 结构，然后导入到Chem3D 19.0中获得化合物小分子的3D 结构，并保存为Mol2 格式，导入到Pymol 中，对其进行去水、移除靶蛋白中的配体，该配体及处理过的靶蛋白分别保存为PDB 格式。从RCSBPDB 数据库中获取靶蛋白的3D 结构。采用AutoDockTools1.5.6 对化合物小分子及靶蛋白结构转化为pdbqt 格式，并设置其活性口袋，运行vina 1.1.2进行分子对接，采用PyMol 对结果可视化分析。

2 结果

2.1 药物靶点的获取

初步获得金樱子化学成分48 种、芡实化学成分26 种，经ADME 筛选后共获得金樱子6 种活性成分、芡实1 种活性成分，见表1。金樱子成分作用靶点158 个、芡实成分作用靶点22 个，合并后删除重复靶点共得到166 个靶点。

表1 水陆二仙丹主要成分

2.2 “药物-活性成分-靶点”网络图构建

“药物-活性成分-靶点”网络图中，共得到176 个节点，272 条边，菱形代表药物，正三角代表药物活性成分，椭圆代表药物靶点。见图1。

图1 “药物-活性成分-靶点”网络图

2.3 疾病靶点的获取

在Genecards 数据库获得DN 靶点3319 个，该靶点Score 中位数为3.18，故设定Score≥3.18的靶点为DN的潜在靶点。结合TTD、OMIM、DRUGBANK 数据库补充相关靶点，4 个数据库靶点结合删除重复值，得到1261 个靶点。

2.4 维恩图及PPI 网络构建

“药物-疾病”靶点维恩图中，获得70 个交集靶点，见图2。PPI 网络共有259 条边，平均节点度值为7.4，PPI 富集P<1.0e-16，导出tsv 格式文件及PPI 网络图，见图3。PPI 网络较为复杂，通过Cytoscape 3.7.2 MCODE发现PPI 网络中紧密联系的基因团模块有3 个。见图4。

图2 “药物—疾病”靶点维恩图

图3 “药物-疾病靶点”PPI 网络图

图4 PPI 网络中的紧密分子结构

2.5 GO 与KEGG 通路富集分析

通过Metascape 平台对交集靶点进行通路信号分析，并通过生物信息学平台对结果可视化。GOBP 选取前20 个集群、GOCC 选取11 个 集群、DOMF 选取前16 个集群，每个集群选取1 个代表进行分析，GO结果如图5 所示。水陆二仙丹治疗DN的KEGG 通路图见图6（封四）。

图5 “药物-疾病”交集靶点GO 分析

图6 “药物- 疾病"交集靶点KEGG分析

2.6 “成分-靶点-通路”网络图构建

“成分-靶点-通路”网络图见图7，倒三角代表药物成分，方形代表通路，椭圆形代表靶点，该网络有73 个节点，412 条边。从图中可发现AGE-RAGE 信号通路富集最为显著，槲皮素、叶红素及山柰酚3 种活性成分与该通路密切相关，则槲皮素、叶红素为该通路主要活性成分，与该通路相关的靶点有23 个，其中AKT1、MAPK1、VEGFA 和CCND1 是该通路的主要靶点，与DN的发生机制紧密相关。见表2。

表2 成分-通路-靶点

图7 “成分-靶点-通路”网络图

2.7 分子对接结果

将“2.6”项下主要成分与其对应靶点对接结果所示，槲皮素与叶红素与其对应靶点具有较好的亲和力，槲皮素与MAPK1 对接结合能为-8.5 Kcal/mol，稳定性最高，见表3，分子对接模式见图8。

表3 分子对接结合能

图8 分子对接模式图

3 讨论

本研究从水陆二仙丹中筛选出7 个活性成分作用靶点。通过“药物-活性成分-靶点”网络图分析，推测槲皮素、叶红素、山柰酚是药物的主要活性成分。有研究显示[6-11]，槲皮素能够通过降低机体氧化应激水平、增强肝脏丙酮酸激酶活性及抑制胰岛细胞凋亡起到降糖作用，槲皮素的抗炎、抗氧化应激及抑制肾脏纤维化对肾脏起到保护作用；叶红素相关研究较少，但本研究发现叶红素与多个靶点进行连接，并且与主要靶点有较好的对接活性，提示叶红素具有较好的降糖保肾的作用，值得进一步研究；山柰酚可减轻高糖下的肾小球内皮细胞氧化应激及凋亡，抗感染，防治动脉硬化。

PPI 网络中分离出3 个模块，查阅文献报道对3 个模块参加的生物学过程进行分析[12-16]，第一模块主要参与白细胞趋化性、炎症反应等过程；第二模块主要参与脂多糖的反应、脂质的反应等过程；第三模块主要参与胶原分解、大分子等代谢过程。GO 生物功能分析发现，主要涉及脂多糖的反应，活化氧代谢过程，调控血管生成、细胞凋亡等多个生物学过程。对20 条KEGG 通路分析[17-21]，以AGE-RAGE 通路为主体，可刺激VEGF 增加血管的通透性引起蛋白尿，刺激血管紧张素Ⅱ的产生及在AT1 受体过度表达从而加速DN的恶化；大量文献显示表明[22-24]，AGE-RAGE 通路下游机制较为繁杂，作用机制尚未完全明了，值得进一步研讨。VEGF 通路可刺激心血管生长因子亚家族，促进肾脏微血管的形成，延缓DN的进展，激活内分泌抵抗，调节脂肪细胞中的脂肪分解及碳水化合物的消化吸收减轻糖尿病症状，学者们认为结合能小于-5 Kcal/mol 是分子对接时受体与配体稳定结合的标准，结合能越低分子对接结合稳定性越高[25]，分子对接验证发现活性成分与对应的靶点有较好的对接活性。

水陆二仙丹通过槲皮素、叶红素等活性成分，调控AKT1、MAPK1、VEGFA 等相关靶点的表达，进而干预AGE-RAGE、HIF-1、ErbB 多条通路，调控脂多糖的反应、活化氧代谢过程、血管生成等生物功能发挥治疗DN的作用。