黄龙喷剂对小鼠乳腺癌移植瘤创面愈合的影响*

胡花婷 赖俊耀 李东芳

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，目前发病率居女性恶性肿瘤的第一位，全世界每年约有120多万女性被诊断为乳腺癌[1,2]，我国乳腺癌发病率和病死率也呈明显上升趋势[3]，而其中30%～40% 的患者因发现晚或复发转移后转变为晚期乳腺癌。乳腺癌局部未经手术切除或术后局部复发后极易溃破，形成难愈性创面。而这种恶性肿瘤所致的难愈性创面给患者及家庭造成严重的经济负担和心理压力。在美国，超过600万人遭受难愈性伤口，每年的治疗费用为250亿美元[4]，在欧洲，整个卫生经费的2%用于管理难愈性伤口[5]。恶性肿瘤所致的各种创面问题，是医疗界研究的难点和热点。乳腺癌发病率高，局部为皮肤浅表肿瘤，难愈性伤口发生率高，肿瘤溃破渗液、恶臭，目前临床常规选用一些进口敷料(抗感染、促渗液吸收作用)进行对症处理，疗效有限且治疗费用高。有研究表明[6]传统中医药治疗难愈性创面具有多靶点、多层次、多环节的特点，且剂型多样，强调整体观念，辨证论治，具有清热解毒、活血化瘀、去腐生肌等功效，从而促进创面愈合。

黄龙洗剂为全国名老中医黎月恒教授的临床经验方，经前期临床观察具有促进肿瘤术后创面愈合的功效[7]，但是其仅限于临床观察，作用机制不清。为更好地开展黄龙洗剂的实验研究，我们在建立小鼠乳腺癌移植瘤的基础上，采用黄龙喷剂干预小鼠乳腺癌移植瘤人工创面，进一步探讨其是否具有促进乳腺癌创面愈合的效用，初步探讨其可能的作用机制，以期寻求一种简便效廉的治疗方法来促进恶性肿瘤所致创面的愈合，减轻患者症状和痛苦，具有十分重要的意义和临床推广应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物健康BALB/c小鼠30只，雌性，5～6周龄，体质量18～20 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(湘)2016-0002。每笼5只，SPF屏障系统+层流架饲养，环境适宜、自由进食、饮水，饲料为湖南省肿瘤医院提供的鼠用颗粒饲料。

1.1.2 实验药物黄龙喷剂(生黄芪30 g，龙葵 30 g，苦参 10 g，败酱草 30 g，生大黄15 g，生附片15 g， 地榆 30 g，红花 10 g，桃仁 10 g，五倍子 l5 g，白及30 g，连翘10 g)，参考《中药饮片标准汤剂》[8]，标准汤剂的百分浓度=药材重量/药汁收得量×100%，以每克中药加水约5 ml计算，总水体积的70%加到第一煎中，30%加到第二煎中，滤过，煎好后滤液合并浓缩至所需浓度，并调节中药复方的pH值到7.4，分装于150 ml的喷雾器中，4 ℃保存备用，此中药材出自中医药研究所且由湖南省中医药研究所统一制备。

1.1.3 主要仪器和试剂ACS电子秤(武汉精宜电子称重仪器有限公司)；水合氯醛(上海国药集团生产)；电子显微镜(上海无陌光学仪器有限公司)；4T1乳腺癌细胞株(中科院细胞库)；H-DMEM(美国 GIBCO公司)；胎牛血清及胰蛋白酶(北京索来宝公司)；超净台(美国 BIOLOGICAL 公司)；恒温水浴箱(HH-W420)(江苏省金坛市医疗仪器厂生产)；CO2恒温培养箱( TC-2323 型美国 SHEL-DON 公司)；-80 ℃超低温冰箱(日本 SANYO 公司生产);台式离心机(Anke TDL-40B)(上海安亭科学仪器厂生产)；细胞培养板(北京天连器材有限公司)；外科手术刀；组织剪；无菌纱布等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及传代将冻存的乳腺癌4T1细胞复苏后，于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养、传代，培养至对数生长期，胰酶消化后用无血清DMEM培养基重悬成5×107/ml细胞悬液。

1.2.2 小鼠乳腺癌移植瘤模型采用细胞悬液法，将配置好的乳腺癌4T1细胞株单细胞悬液，在裸小鼠右侧近腋窝第二乳腺脂肪垫深面注射细胞悬液，形成一皮丘，内含0.2 ml细胞悬液(1×107)个，共接种30只，待小鼠移植瘤大小约2 cm时，乳腺癌小鼠移植瘤模型建立成功。

1.2.3 小鼠移植瘤人工创面的建立将建模成功的小鼠采用经典的全层皮肤切割伤模型，在无菌条件下，沿小鼠移植瘤皮肤面，用外科方法作切取全层皮肤，切取2 cm×2 cm的造模面积；建立全层皮肤缺损开放性创面模型；创面加盖两层消毒干纱布，医用胶布固定，造模后每只裸小鼠连续3 d后肢肌肉注射青霉素40万U预防感染。

1.2.4 分组及给药方法采用随机数字表法分组，随机分为黄龙喷剂组、康复新组、空白对照组，每组10只小鼠。黄龙喷剂组予以黄龙喷剂外喷，每次5 ml，每日2次。康复新组予以康复新溶液外喷，5 ml/次，2次/d。空白对照组不做任何处理。黄龙喷剂组和康复新组均连续外喷药物10 d。

1.3 观察指标

1.3.1 小鼠一般情况及创面情况观察用药后小鼠的进食状况，创面有无肿胀、渗出、坏死及出血，创面有无感染发红，有无新生肉芽组织等。

1.3.2 创面愈合时间创面愈合时间是评价创面愈合的传统指标之一，是指创面完全上皮化所需的时间，创面上皮化依靠肉眼的观察，记录不同时间点创面上皮化的时间。

1.3.3 创面愈合率记录原始创面面积和未愈合创面面积，按下列公式计算创面愈合率：愈合率= (原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%，面积测量方法采用数码相机拍照行计算机image-pro-plus数码图像分析软件分析创面面积，进行计算。

1.3.4 创面组织病理学检测取少量创面组织进行病理组织学检查，观察创面组织炎性细胞的浸润，新生血管及新生纤维细胞增生的情况，探讨黄龙喷剂促进创面愈合的初步可能机制。

2 结果

2.1 小鼠一般情况及创面情况造模后各组小鼠均出现精神萎靡、进食减少、活动减少等情况，黄龙喷剂组小鼠于用药后第3天恢复正常，其他2组小鼠活动减少、食少。造模第1天各组小鼠创面均有水肿、渗血。用药第2天后黄龙喷剂组及康复新组小鼠创面组织周围水肿、渗血均消失，空白对照组于第3天水肿、渗血消失。用药3 d后黄龙喷剂组及康复新组创面均有少量渗出，创面无坏死及感染，黄龙喷剂组创面周围及基底部可见少许肉芽组织颗粒，可见新生上皮由四周向中心生长，空白对照组创面有较多渗出。用药1周后，黄龙喷剂组创面较前缩小，创面被肉芽组织覆盖，呈暗红色，康复新组创面缩小低于黄龙喷剂组，可见少量肉芽组织覆盖创面周边，空白对照组创面周边可见少量肉芽组织，长势均不及黄龙喷剂组及康复新组。黄龙喷剂组小鼠创面均于10 d前已全部愈合，而康复新组及空白对照组有部分小鼠第10天才愈合，愈合缓慢。

2.2 创面愈合时间黄龙喷剂组创面的平均愈合时间少于空白对照组和康复新组，且差异存在统计学意义(分别为P<0.01和P<0.05)。康复新组创面的平均愈合时间较空白对照组短，差异具有明显统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 3组小鼠创面愈合时间比较 (只，

2.3 创面愈合率在第3天开始，黄龙喷剂组和康复新组创面愈合率与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；第5天到第10天，黄龙喷剂组创面愈合率与康复新组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组小鼠不同时间段创面愈合率比较 (只，

2.4 创面组织病理学检测病理检查提示空白对照组创面周边可见较少肉芽组织，可见较多炎性细胞浸润，成纤维细胞较少，可见少量新生血管。康复新组可见肿瘤边缘片状坏死及出血，可见较多炎性细胞浸润，成纤维细胞较黄龙喷剂组少，且细胞体较黄龙喷剂组偏小，毛细血管数目及大小不及黄龙喷剂组，黄龙喷剂组成纤维细胞数量较多，体积较大，创面肉芽组织血管丰富，可见散在炎细胞浸润。见图1。

图1 小鼠乳腺癌创面HE染色

3 讨论

乳腺癌所致的创面多为乳腺恶性肿瘤细胞浸润皮肤穿透上皮形成或乳腺癌术后放疗后所致，局部表现为红肿、溃疡、疼痛等，中医称乳腺癌为“乳岩”“乳石痈”，其病因病机为气机郁滞、正气亏虚、瘀毒互结，治疗当以清热解毒、活血止痛、生肌敛疮为主。黄龙喷剂具有清热解毒、活血止痛、生肌敛疮的功效，切中乳腺癌的病因病机，临床使用疗效显著，前期临床观察表明黄龙喷剂具有促进直肠癌Mile’s术后局部血液循环，促进肉芽生长，加速伤口愈合的作用[7]，主要由生黄芪、龙葵、苦参、败酱草、生大黄、生附片、地榆，红花、桃仁、五倍子、白及、连翘组成。方中黄芪味甘，性温，入肺、脾二经，具有内托已溃疮疡，生肌收口，外固表止汗，腠理充盈之功效，为君药。龙葵、败酱草、连翘、生大黄味苦，性寒凉，具有清热解毒，消痈排脓之功效，共为臣药。桃仁、红花活血化瘀，散瘀止痛；白及味苦，性凉，具有收敛止血，消肿生肌之功效；地榆味苦，酸涩性寒，具有凉血止血，解毒敛疮之功效；苦参清热燥湿，收湿敛疮；附片辛甘大热，补命门衰败之火，以生脾土，脾土健，则气血生化有源，共为佐药。五倍子涩苦微酸，具有收敛创口之功效，为使药。全方寒热相宜，燥湿相济，温补清消，诸药合用，共奏清热解毒、生肌敛疮、活血化瘀之功。多项研究发现中医药可以促进创面肉芽组织生长、调控表皮生长因子的合成和分泌、促进细胞分裂增殖、促进内皮细胞的生长、刺激创面新生血管形成、改善创面的血液循环、调控胶原的合成及代谢、调节创面修复基质形成、营养创面等作用，从而促进创面愈合[9]。但目前对于中医药作用于恶性肿瘤所致创面的研究多以临床观察为主，实验研究鲜有报道，大多限于临床观察，其促进恶性肿瘤所致创面的机制不清。本研究采用小鼠乳腺癌移植瘤创面模型探讨黄龙喷剂干预其创面的作用，结果表明黄龙喷剂相对于康复新组及空白对照组可以减少创面愈合的时间，提高创面愈合率，可能与其减轻炎症反应，增加胶原纤维的增生，促进毛细血管的生长，改善创面血液循环有关。但本实验观察时间较短，未于不同时间点取标本进行病理组织学检测，不能反映创面愈合改变的病理变化的全过程，且未进行免疫组化，使得实验数据不够深入且存在一定的偏差，望在后期实验中进一步完善。