芦竹属菌草内生固氮菌nifH基因的表达研究

李 曼，李巧琪，廖 真，林标声，鲁国东，林占熺

(1.福建农林大学生命科学学院, 福建 福州 350002; 2.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002; 3.龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩 364012; 4.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

【研究意义】植物内生固氮菌是指能够在玉米、水稻、牧草等许多植物体内定殖并进行联合固氮作用的一类微生物[1]，其在植物体内占据着重要生态位，通过联合固氮作用为宿主植物提供氮素或其他促生长物质[2-4]。植物内生固氮菌的种类不同，为寄主提供氮源的效率、产生植物激素类物质、促进宿主的生理变化也不同[5]。nifH基因是固氮微生物菌株最保守的功能基因[6-7]，是固氮微生物研究的理想遗传标记，nifH基因作为编码固氮酶的结构基因在生物固氮中发挥着重要作用[8]。芦竹属菌草(Arundosp.)绿洲属多年生禾本科植物，其有粗而多节的根茎，茎秆直立、根系发达，绿洲不仅可以避免大面积水土流失，而且能大量吸收保持地表水，生长快，覆盖性强，具有耐寒、耐高温、耐旱、耐盐碱及抗逆性强等优良特点。开发内生固氮菌不仅可以作为微生物制剂或菌肥应用于农业中，也可以为进一步丰富和完善禾本科植物内生固氮菌种质资源库奠定理论基础。【前人研究进展】实时荧光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出 ,由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃 ,而且与常规 PCR技术相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点, 目前广泛应用于研究mRNA的表达、各种基因定量分析、单核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传染病进行定量定性分析等[9]。目前已有不少学者研究禾本科植物内生固氮菌nifH基因，但关于芦竹属菌草绿洲固氮基因nifH的报道较少。【本研究切入点】本研究将qRT-PCR技术应用于芦竹属菌草样本固氮基因nifH的定性定量分析，旨在丰富和完善禾本科植物内生固氮菌种质资源库。【拟解决的关键问题】通过qRT-PCR技术快速准确的检测到5种芦竹属菌草成熟期根部内生固氮菌nifH基因的拷贝数及相对表达量的变化情况。

1 材料与方法

1.1 样本的采集及处理

样本采集于福建农林大学城菌草种植基地，分5个样区采集5种绿洲，每个样区分3个样点，每个样点随机选取1株菌草，5个样区共采集15株菌草绿洲成熟期的根部带回实验室处理。

1.2 培养基及主要仪器

1.2.1 培养基 LB 液体培养基[10]，LB固体培养基[11]。

1.2.2 主要仪器 主要仪器如表1所示。

表1 主要仪器及型号

1.3 样品的表面消毒

样本采集结束后，先用流水冲洗1～2 h,再依次用75%乙醇浸泡2 min，2%次氯酸钠浸泡5 min后，用无菌水冲洗4次，再将最后一次冲洗后的无菌水洗涤液涂布于LB培养基中培养1～2 d，以此检验消毒是否彻底[12]。

1.4 基因组DNA的提取、固氮基因nifH可变区扩增及qRT-PCR

采用快速无毒DNA提取试剂盒，提取5种绿洲成熟期根部DNA，提取完成后，使用1%琼脂糖凝胶电泳观察提取的基因组DNA片段并测其OD值。以提取的基因组DNA为模板，采用PCR仪扩增固氮功能基因nifH的片段。引物序列为nifH-F5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′，nifH-R5′-T TGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′[13]。PCR，qRF-P CR反应体系及程序如表2所示。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，使用Axy Prep DNA 凝胶回收试剂盒回收目的片段。向PCR管中加入4 μL胶回收片段，从表面小心吸取1 μL质粒，加入管中，用稍大的枪，轻轻混匀20次左右，用手加热5 min至30 ℃左右。向1.5 mL EP管中加入感受态的大肠杆菌50 μL，再加入连接产物5 μL，轻轻混匀，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，水浴5 min，结束后向EP管中加入600 μL LB液体培养基(此过程须在超净工作台中进行)，37 ℃，150 r/min，培养2 h。转化成功后涂布于含有氨苄卡那霉素的LB平板上，培养24 h后观察平板菌落生长状况，挑选白色菌落作为阳性转化子进行PCR鉴定，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并提取质粒作为样本nifH基因绝对定量的标准品。提取质粒标准品从101～105进行10倍梯度稀释，每个梯度取2 μL作为反应模板建立标准曲线。

表2 PCR、qRT-PCR反应体系及程序

1.5 RNA的提取、反转录、nifH基因的扩增及qRT-PCR

使用TRIzol Reagent提取各样本RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测及微量核酸测定仪测其OD值。随后将提取的RNA反转录成cDNA。反转录总体系 20 μL，其中Master Mix 10 μL、SUPERSCRIPT Ⅱ Reverse Transcriptase 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimerScript Buffer2 4.0 μL、RNase-free H2O 4.0 μL。将各样本的反转录产物作为模板，设计nifH(目的基因)及16S(内参基因)两对引物分别进行PCR反应。引物序列分别为nifH如表2所示，16S-F5′-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3′；16S-R5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′。PCR反应总体系如表2所示，建立溶解曲线后，将cDNA样品模板进行10倍稀释，5梯度，各检测3个复孔。选用16S作为内参基因，与目的基因nifH分别进行Realtime PCR反应，获取两个基因的扩增曲线、溶解曲线及Ct值，按2-ΔΔCt法分析所获得的数据。

2 结果和分析

2.1 芦竹属菌草成熟期根样本nifH基因定量分析

如图1-a所示，5个质粒标准品扩增曲线较光滑，倾斜度较大，呈现典型的S型曲线，且各循环阈值间隔较均匀。根据扩增曲线提供的标准品各梯度稀释浓度反应的循环阈值(Ct值)，绘制出反应的标准曲线(图1-b)。该标准曲线方程为Y=-3.053X+40.509,相关系数R2=0.99，斜率K=-3.053。样本扩增曲线各线后期均趋于平稳；溶解曲线中各样本曲线均为单一尖锐峰，未出现其他杂峰，Tm为81.47 ℃，故不存在非特异扩增产物或引物二聚体。

通过qRT-PCR技术测定了5种芦竹属菌草成熟期根样本nifH基因的拷贝数(图2)，5种芦竹属菌草成熟期根nifH基因拷贝数逐步递减，拷贝数差异较大，其中，绿洲1号nifH基因拷贝数最高，达8.84×1011/g；绿洲5号nifH基因拷贝数最低，达1.54×1011/g，各样本差异均达到显著水平(P<0.05)。

2.2 芦竹属菌草成熟期根样本的nifH基因相对表达量分析

通过qRT-PCR技术测定5种芦竹属菌草内生固氮菌nifH基因的相对表达量(图3)，所得原始数据采用2-ΔΔCt法定量计算公式进行相对定量分析，即绿洲2、3、4、5号样品目的基因nifH相对于参照样品绿洲1号相对表达量的差异(图4)，结果表明，绿洲2号成熟期根样本固氮nifH基因表达量最高，约为15.69，已达到过表达水平；而绿洲1号nifH基因表达量最低，其数值为0.84，绿洲2号nifH基因相对表达量为绿洲1号的18倍。其中，绿洲2号差异达到显著水平(P<0.05)，其余各样本差异均不显著。

3 讨 论

本文采用实时荧光定量PCR技术测定了5种芦竹属菌草内生固氮菌nifH基因的拷贝数及相对表达量，结果表明，5种芦竹属菌草成熟期根样本固氮基因nifH的拷贝数及相对表达量均存在较大的差异。在定量分析中，样本拷贝数的变化呈逐步递减趋势，绿洲1号样本nifH基因拷贝数最高，且各样本nifH基因拷贝数差异均达到显著水平(P<0.05)；在定性分析中，绿洲2号样本nifH基因相对表达量则最高，呈过表达水平，且差异达到显著水平，而绿洲1号固氮基因nifH的表达量最低。

由于绝大多数实验表明禾本科植物内生固氮菌大部分来自成熟期根部，侯伟等[14]研究发现分离得到的 40 株内生固氮菌绝大多数来源于根内，这种分布趋势与固氮菌本身属性有关。林标声等[15]研究发现巨菌草在同一生长时期的内生固氮菌群丰度和多样性均是根>叶>茎，且根的固氮酶活性在成熟期达到最高。毛晓洁[16]研究发现，对分离到的玉米内生固氮菌从门、纲、目、属、种5个分类学等级进行统计分析，结果表明其多样性为根部>叶部>茎部，与林标声等[15]的研究结果一致。因此，本研究选择5种芦竹属菌草成熟期根部内生固氮菌作为研究对象，以检测其固氮基因nifH在mRNA水平上的表达情况和定量变化情况。

综上所述，结果表明，该5种芦竹属菌草成熟期根样本内生固氮菌nifH基因的拷贝数及表达量均存在较大差异，绿洲1号nifH基因拷贝数最高，达8.84×1011/g；而固氮基因nifH相对表达量则是绿洲2号最高，且呈过表达水平。芦竹属菌草作为栽培食药用菌的栽培料，是荒漠化地区恢复植被的优良草种[17]，是喂养食草性动物适口的饲料，且植物内生菌的研究已经成为当前微生物学的热点之一，是待开发的资源宝库[18-19]。因此，利用qRT-PCR技术检测5种菌草成熟期根部nifH基因的拷贝数及相对表达量，检测结果表明，绿洲1号根部固氮菌的数量较多，绿洲2号根部固氮酶活性较强，该结果为今后植物固氮领域的研究及内生固氮菌的应用提供理论依据。