1株海洋草酸青霉HY181-2的分离鉴定及其对金线莲茎腐病病原菌的生防能力

林文珍，郭迟鸣，郭 莺，林志楷，陈 菲，刘黎卿

(1.福建省亚热带植物研究所，福建 厦门 361006；2.福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006)

【研究意义】金线莲(Anoectochilus)为多年生珍稀草本植物，坊间又叫金线草、金丝草，广泛分布于福建、浙江、台湾等东南沿海省(区)及云南、贵州等西南地区[1]。金线莲不仅具有观赏价值，例如：盆栽，组盆种植等；还是珍贵中草药，具有极高的药用价值。金线莲喜阴，其生长对环境和土壤的要求较高，故生长较为缓慢，繁殖能力较低，在自然环境中分部虽然广但不集中[2]。近年来，随着我国人民生活水平的提高，民众对养生保健愈发重视，导致野生金线莲私采滥挖现象屡禁不鲜[3]。自20世纪80年代初起，我国就开展了对金线莲的人工栽培技术、药理活性等方面的研究[3-6]。目前市面所售的金线莲产品大部分为人工种植，包括大棚栽培和仿野生林下种植。随着金线莲人工种植产业的扩大，其内在隐患也渐渐显露。金线莲野生资源的萎缩和现有品种的老化[7]，茎腐病、灰霉病等土传病害不断蔓延，都严重制约着金线莲产业的发展，其中茎腐病已成为金线莲人工种植的重要病害之一。金线莲茎腐病的致病菌株为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，是一种土传的微生物菌害，在人工栽培金线莲的所有阶段都可能被其侵染。特别是在组培苗转移至大棚和林下栽培初期，植株抗病能力较弱，幼苗如发生茎腐病，极易出现大面积倒伏、死亡现象[8]。茎腐病与软腐病发病初期极为相似，大多由植株茎基部开始发病[9]，病斑黄褐色呈水渍状，5～7 d病斑迅速蔓延至茎周，病发茎组织腐烂干枯后塌缩呈线状；叶片呈现黑黄干卷曲状。该病传染力强、爆发率高的特性严重影响着福建乃至全国金线莲产业的发展，影响产品品质的同时也打击了广大种植户的积极性。因此，加强对茎腐病等金线莲常见病害的防治研究，不仅能带来经济效益，更能一定程度上解决民生需求。【前人研究进展】目前对金线莲病害防治的研究，较多集中在化学杀菌剂的混合喷施以及病害的分离鉴定上[8, 10-11]。化学防治是防治金线莲病害的重要手段之一，但化学农残所带来的食品安全和生态安全问题也日益加重[12]。国内关于金线莲茎腐病病害防治的最新文献为卓飞等[13]对海南省金线莲种植中主要病虫害防治的研究，其中针对茎腐病提出的防治措施主要是发病前期使用戊唑醇乳油、腈菌唑可湿性粉剂和多菌灵等化学杀菌剂对土壤喷施。截止目前对金线莲茎腐病的生物防治相关研究较少，张淑芬等[14]利用木霉属AHS06菌株制成的生防菌剂对金线莲茎腐病开展了生物防治试验，蔡金池等[15]发现TA菌株的发酵液对金线莲茎腐病具有较好的防治效果。为应对国外日益高筑技术壁垒的新形势，不控制农药残留，将无法适应出口要求，因而活体微生物农药是生物防治的物质基础和重要手段。【本研究切入点】本试验对福建东山珊瑚自然保护区珊瑚样本进行处理时分离到一株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)HY181-2。通过平板对峙初筛试验，发现其对金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌(F.oxysporum)JXL具有拮抗作用。为进一步验证HY181-2除菌落生长的竞争性作用之外，其次级代谢产物是否也具有抑菌功能，对HY181-2进行了小量发酵试验，获得发酵萃取物。通过气相色谱-质谱分析发酵萃取物组分，并利用菌丝生长速率法，分别测定海洋来源真菌草酸青霉(P.oxalicum)HY181-2发酵萃取物和4种化学杀菌剂对金线莲尖孢镰刀菌的室内毒力测定。【拟解决的关键问题】当前国内的农用微生物制剂还较少，国内外的微生物制品都存在着作用单一、抑菌谱窄、性价比不高等问题，且多数制品的功能活性物质来自陆源微生物。故开发新的安全、低毒、高效、无残留、无污染的海洋来源微生物制剂，具有广泛的应用前景。本研究结果为开发防治金线莲茎腐病的微生物制剂提供了理论与技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试培养基与主要试剂 查氏培养基、YM培养基、PDB培养基、PDA培养基、淘米水培养基(取淘米水用8层纱布过滤，灭菌备用)、玉米培养基(200 g玉米碎，加水煮30 min后，纱布过滤，取滤液用蒸馏水补足至1000 mL灭菌备用)；乙酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇等。

1.1.2 供试菌源 供试金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)JXL,由福建省亚热带植物生理生化重点实验室从厦门、漳州和龙岩等地金线莲种植基地采集的金线莲茎腐病病株中分离、纯化并保存。海洋来源草酸青霉(Penicilliumoxalicum)HY181-2，由自然资源部第三海洋研究所徐炜博士提供的福建东山珊瑚自然保护区珊瑚样本中分离、纯化和培养获得。菌株保存和活化均使用PDA培养基。

1.1.3 供试杀菌剂 海洋来源草酸青霉(P.oxalicum)HY181-2发酵萃取物(福建东山珊瑚自然保护区珊瑚样本)、25%吡唑醚菌酯(山东康乔生物科技有限公司)、50%多菌灵可湿性粉剂(江苏三山农药有限公司)、10%苯醚甲环唑(中国农科院植保所廊坊农药中试厂)、80%代森锰锌可湿性粉剂(山东省济南一农化工有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 供试菌株的分离与纯化 将自然资源部第三海洋研究所徐炜博士提供的福建东山珊瑚自然保护区珊瑚样本在无菌超净台敲碎，分别放入查氏培养基、YM培养基、PDB培养基、淘米水培养基和玉米培养基中，28 ℃摇瓶培养1～2 d。取发酵液分别在各自对应的培养基平板上以10倍梯度稀释涂板，并置于28 ℃恒温箱中培养5～7 d，每天观察生长情况并挑取单菌落进行纯化。筛选过程中发现一株具有潜在抑菌作用的真菌，分布在其菌落四周的其他菌株的菌落，大多呈现出一定的受抑菌现象。本实验室即对该真菌进行多次纯化，并将获得的菌株命为HY181-2。

1.2.2 供试菌株的鉴定 菌株HY181-2形态学鉴定：将纯化后的菌株HY181-2接种至PDA培养基，28 ℃恒温、避光培养4～5 d，观察菌落特征。

菌株HY181-2分子生物学鉴定：，采用Fungal DNA Kit 的方法提取菌株HY181-2的菌丝体DNA,扩增ITS序列[16]，将扩增产物由上海捷瑞生物工程有限公司测序。测序结果通过NCBI进行BLAST比对分析，并从NCBI上下载同源性较高的碱基序列，用软件MEGA6进行系统发育树的构建，以明确菌株HY181-2的分类地位。

1.2.3 菌株HY181-2对菌株JXL的拮抗作用 将菌株HY181-2和JXL分别接种至PDA平板，28 ℃恒、避光培养4～5 d，选取菌落边缘的菌块。将菌株JXL菌块置于平板中央，在其两边对称位置分别放置菌株HY181-2菌块和空白培养基块。28 ℃恒温箱中避光培养，直至菌株JXL菌丝生长至培养皿边缘，每个处理设3个重复。

1.2.4 菌株HY181-2小量发酵并获取发酵液萃取物 将菌株HY181-2接种至PDA培养基中活化培养2～3 d，从菌落边缘挑取菌丝接种至PDB培养基，28 ℃、160 r/min避光振荡培养7 d后，分离菌体获得发酵液。加入与发酵液等体积的乙酸乙酯，充分振荡后静置。待乙酸乙酯与发酵液完全分层后，取有机相溶液通过EYELA的旋转蒸发仪去除多余的乙酸乙酯，旋蒸瓶内所得的即为菌株HY181-2发酵液萃取物。

用10 mL左右的甲醇对旋蒸瓶内的萃取物进行复溶，并辅助以超声溶解。将获得的萃取物置于离心机中，4 ℃、20 000 r/min离心10～15 min，去除不溶物。将上清液EP管中，45 ℃、1000 r/min浓缩2 h。计算菌株HY181-2发酵液萃取物的重量。可根据试验需要用二甲基亚砜(DMSO)或甲醇对萃取物再次复溶，配置成浓度为100 mg/mL的母液，冷藏或冷冻备用。

1.2.5 菌株HY181-2发酵液萃取物气相色谱—质谱分析 用甲醇对菌株HY181-2发酵液萃取物再次复溶，配置成浓度为20 mg/mL的母液，4 ℃、20 000 r/min离心30 min，取上清去除不溶物用于气相色谱-质谱分析。

GC-MS条件。色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm膜厚)。载气为高纯氦气，99.999%。进样口温度：250 ℃。分流进样，分流比5∶1。色谱-质谱接口温度：280 ℃。离子源温度：230 ℃。离子化方式：EI。电子能量：70 eV。扫描范围：40～500 amu。程序升温参数：60 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至210 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升到310 ℃，保持15 min。

1.2.6 供试杀菌剂母液配制 用二甲基亚砜(DMSO)将HY181-2发酵萃取物稀释成所需系列质量浓度的10倍母液，用无菌超纯水将其他杀菌剂稀释成所需系列质量浓度10倍的母液，各杀菌剂母液浓度梯度为各杀菌剂有效成分的浓度梯度。依据前期预试验结果，设定各个杀菌剂浓度梯度。HY181-2发酵萃取物浓度梯度设定为0.1、1、10、50、100 mg/L，25%吡唑醚菌酯浓度梯度设定为0.1、1、10、50、100 mg/L，50%多菌灵可湿性粉剂浓度梯度设定为1、10、50、100、1000 mg/L，10%苯醚甲环唑浓度梯度设定为0.1、1、10、50、100 mg/L，80%代森锰锌可湿性粉剂浓度梯度设定为1、10、50、100、1000 mg/L。

1.2.7 梯度培养基的配制 按照设定的浓度梯度，将各杀菌剂母液以1∶9的比例加入融化的PDA培养基中，混合均匀后倒入9 cm培养皿，即为配制所需质量浓度的含毒培养基。同时将不含HY181-2发酵萃取物的DMSO也以1∶9的比例加入融化的PDA培养基中，作为含HY181-2发酵萃取物的含毒培养基的阴性对照，并以不含杀菌剂的PDA培养基作空白对照(CK)。

1.2.8 室内毒力测定方法 采用菌丝生长速率法测定[17]，将尖孢镰刀菌接种至空白PDA培养皿中，26 ℃培养5 d。使用打孔器选取菌龄一致的菌饼(直径7 mm)，并接种于含毒培养皿、阴性对照培养皿和空白对照PDA培养皿中央，每个处理做3次重复，26 ℃恒温倒置培养5 d。5 d后取出，应用十字交叉法[18]测量每个培养基的菌落直径，将测得的各菌落直径减去原菌饼直径(7 mm)，得出最终菌落纯生长直径，用于计算供试杀菌剂每个处理对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率。

菌丝生长平均抑制率(%)=[空白(CK)对照纯生长直径-试验处理组纯生长直径]/空白(CK)对照纯生长直径×100

运用Microsoft Excel 求出抑制率机率值(y)与浓度对数(x)之间的毒力回归方程、每种杀菌剂的抑制中浓度EC50[17]及相关系数(r)[19]。

2 结果与分析

2.1 菌株HY181-2的鉴定

2.1.1 菌株HY181-2的形态特征鉴定 菌株HY181-2菌落整体较为平坦(图1-a、图1-b)，菌落中间有明显的突起小环，菌落呈地毯式蔓延生长，菌落周边有一圈白色菌丝，质地绒状，菌落中间呈青绿色，而白色与青绿色交界处的菌丝呈现出淡黄绿色。HY181-2菌丝初期为白色，后浅黄至浅绿最后至青绿色，表面呈密毡状，产生大量分生孢子，且分生孢子极易飞扬；菌落反面呈淡黄色，周边无明显色素产生。

菌株HY181-2分生孢子梗有分隔(图1-c)，具有帚状枝小梗，帚状枝通常双轮生，偶有三轮生或单轮生；孢子常为链状生长，多为球形，表面光滑；孢子形成后浅黄至浅绿最后至青绿色。

根据在PDA上生长的菌落形态和显微镜镜检结果，结合参照《中国真菌志》[20]和《真菌鉴定手册》[21]，菌株HY181-2符合青霉属的生长特性，初步确认该菌为青霉属(Penicillium)真菌。

2.1.2 菌株HY181-2的分子鉴定 用通用引物ITS4和ITS5对菌株HY181-2的DNA序列进行扩增，测得碱基序列(图2)。

将菌株HY181-2的ITS序列在NCBI中进行BLAST 比对，HY181-2与已发表的相关青霉属(Penicilliumsp.)菌株的序列同源性为100%。利用软件MEGA6构建以青霉属rDNA-ITS 序列为基础的系统发育树(图3)，菌株HY181-2与草酸青霉(Penicilliumoxalicum，HM053477.1)的进化距离最近。

结合形态学鉴定结果，最终将菌株HY181-2鉴定为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。菌株HY181-2已于2020年8月14日由广东省微生物菌种保藏中心收到，并登记入册。保藏号：GDMCC No:61142。

2.2 菌株HY181-2对尖孢镰刀菌JXL的菌丝抑制作用

生防菌指利用有益微生物杀灭或压低病原生物数量以控制或预防植物病害发生、发展的一类措施。

其生防功能特点主要包括两个方面，一是生长速度快，包括菌丝、菌体生长速度快和产孢能力强，能在短时间内迅速占领生长空间，与病原菌进行营养竞争；二是其独特的具有杀灭或是抑制病原微生物生长的次级代谢产物。

将HY181-2菌块接种在PDA平板上，28 ℃避光恒温培养7 d，菌落直径可达5 cm，产孢能力极强，3 d内HY181-2菌块上白色菌丝迅速产生大量分生孢子，并且孢子极易脱落，轻微振动可远距离传播，并迅速扎根生长，说明菌株HY181-2具有生防菌生长快的特点。结合试验前期粗筛结果，将菌株HY181-2与病原菌JXL进行平板对峙试验，进一步研究其生防能力。

平板对峙试验表明，菌株HY181-2对病原菌JXL具有较强的抑制作用(图4-a、图4-b)，呈现出明显的抑菌圈。病原菌JXL菌落被抑制的部分呈紫红色，对菌丝进行镜检(图4-c)，发现被抑制部分的菌丝与未被抑制部分的菌丝有较大的区别，被抑制部分的菌丝提前进入成熟、老化阶段，产生大量的分生孢子。表明，菌株HY181-2对病原菌JXL具有拮抗作用，具有开发成生防菌的潜力。

2.3 菌株HY181-2发酵液萃取物的气相色谱—质谱分析

为验证菌株HY181-2的次级代谢产物是否具有抑菌能力，将菌株HY181-2进行小量发酵，每升发酵液当中获得259 mg的萃取物。将发酵液萃取物溶液进行气相色谱—质谱分析(图5)。

表1 5种杀菌剂对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果

表2 5种杀菌剂对尖孢镰刀菌的室内毒力回归方程

通过GC-MS研究发现，HY181-2的发酵萃取物中主要包括脂肪酸类(图5-峰1，图5-峰2，图5-峰3)、蒽醌类(图5-峰4)、甾体类(图5-峰5，图5-峰6，图5-峰7，图5-峰8，图5-峰9)等多种成分，这些次级代谢产物具有抗氧化、抑菌、抑制体外肿瘤细胞生长、抑制酶活性等作用[22-24]。

2.4 室内毒力测定

为更直观地了解菌株HY181-2次级代谢产物的抑菌能力，进行了室内毒力测定。由表1～2可知，菌株HY181-2发酵萃取物与其他4种杀菌剂对金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌JXL均有抑制作用。但病原菌菌丝对不同的杀菌剂敏感度差异较大，而DMSO对菌丝生长的抑制率仅为1.1%，几乎可以忽略。10%苯醚甲环唑的抑菌效果最好，EC50值为0.16 mg/L，且对菌丝生长的抑制较为敏感，浓度仅为0.1 mg/L时，抑制率就已达44.66%。HY181-2发酵萃取物和25%吡唑醚菌酯的抑菌效果次之，EC50值分别为2.72和2.02 mg/L；但吡唑醚菌酯随着浓度的升高，对菌丝生长的抑制效果提高的并不明显，浓度从0.1 mg/L升至100 mg/L，抑制率仅提高了14.96%。80%代森锰锌可湿性粉剂的EC50为244.02 mg/L；相比之下50%多菌灵可湿性粉剂的抑制效果最差，金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌对80%代森锰锌可湿性粉剂的敏感度最低，其EC50值高达2794.24 mg/L。

3 讨 论

致病性尖孢镰刀菌是种世界性的土传真菌病害之一，可侵染多种作物[25]。本研究表明金线莲茎腐病的病原菌为尖孢镰刀菌，与赵云青等[8]的结果一致。传统的化学农药是防治病虫害的重要而有效的手段之一，但生物防治是一条更为理想和环保的途径。抑菌实验结果表明菌株HY181-2及其次级代谢产物对尖孢镰刀菌JXL具有良好的抑制作用，也表明HY181-2的次级代谢产物中具有抑菌活性物质，与马新玥等[26]的结果一致。本研究中GC-MS结果发现HY181-2的次级代谢产物具有抗氧化、抑菌、抑制体外肿瘤细胞生长、抑制酶活性等多种作用，这与王培乐等[27]关于海源草酸青霉活性产物的独特性与多样性的研究结果一致。本研究所选取的4种抑菌剂均属于低毒高效的广谱抑菌剂。室内毒力测定结果表明，菌株HY181-2发酵萃取物和4种化学杀菌剂，对尖孢镰刀菌JXL均有抑制作用。虽然在同一浓度的情况下，相较于共试4种化学杀菌剂而言，菌株HY181-2发酵萃取物对菌株JXL菌丝的抑制作用不是最佳的。但随着浓度的升高，菌株HY181-2发酵萃取物对菌株JXL菌丝的抑制效果依然十分显著，当浓度为100 mg/L时，抑制率高达85.03%。而在此浓度下25%吡唑醚菌酯的抑制率为57.76%，50%多菌灵可湿性粉剂的抑制率为40.06%，10%苯醚甲环唑的抑制率为94.97%，80%代森锰锌可湿性粉剂的抑制率为48.94%。以毒力指数为指标，菌株HY181-2发酵萃取物在此次室内毒力测定试验中效果仅次于10%苯醚甲环唑。但菌株HY181-2发酵萃取物为微生物生长代谢所得，相较于化学杀菌剂而言，来源安全、健康、无农残，并且可以随着微生物的生长源源不断的获取。若将HY181-2开发成相应的微生物制剂应用于实际生产，不仅可以减少化学农药的使用量和使用频率，进一步减低农残，还可以减少种植户的生产成本。

金线莲整个生长周期均有可能感染茎腐病，且该病病势迅猛，极易在短期内出现大面积倒伏[8]。除在茎腐病发病时使用生物和化学抑菌剂进行补救外，提高田间管理水平和力度也十分重要[3]。该研究的药剂筛选只反映出了生防菌HY181-2和4种化学药剂的室内效果，田间的实际使用效果以及混合施用效果等问题还有待进一步研究。同时，有研究表明[28]，不同的药剂剂型对防治的效果也有影响。因此，研究合适的生防菌剂型同样具有重要意义。

4 结 论

从福建东山珊瑚自然保护区珊瑚样本中分离得到的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)HY181-2对金线莲茎腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)JXL具有较强的抑制作用。小量发酵获得萃取物的结果显示其发酵液当中的次级代谢产物产量能达到259 mg/L。菌株HY181-2同时具有生防菌所具备的生长速度快和代谢活性产物的特点，后期可开发利用的潜力较大。室内毒力测定结果表明菌株HY181-2次级代谢产物在相同浓度条件下有着不弱于常规化学杀菌剂的抑菌能力。菌株HY181-2具有开发成防治金线莲茎腐病的生物农药的价值和潜力，并且其所具有的生长快和代谢活性产物的双重特性表明，菌株HY181-2可用于不同剂型的研制。