44例反复多次治疗的结核病患者耐药情况分析

宋翌琰 陈洁 郦芳华 李若男 赵静 郁大伟 宋华峰 徐俊驰 吴敏娟 胥萍

2019年全球近50万人罹患利福平耐药结核病，其中78%为耐多药结核病(MDR-TB)。目前，临床上治疗结核病主要使用抗结核药物，科学合理地用药对减少结核病的传播和流行至关重要，对于减少结核病的耐药意义重大[1-3]。为分析多次治疗对患者耐药性产生的影响，本研究收集了苏州大学附属传染病医院2013—2020年间反复多次治疗且治疗时间间隔≥2年的44例结核病患者的资料和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果，分析结核病患者基线和反复多次治疗后的结核分枝杆菌耐药性，以期为临床研究提供理论参考。

资料和方法

一、资料收集

收集苏州大学附属传染病医院在2013年1月至2020年12月间反复多次(治疗次数≥2次)治疗，且初次治疗和最后一次治疗时间间隔≥2年的44例结核病患者的资料和药敏试验结果。患者均为结核分枝杆菌培养阳性，均进行了药敏试验。

二、结核分枝杆菌培养

1.标本前处理：(1)痰液：挑取约5 ml痰液至已标记的50 ml离心试管中，加等量4%氢氧化钠(NaOH)处理液(去污染)；振荡20 min。加无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS；pH值为6.8)至约45 ml，盖紧盖子；以离心半径30 cm，3500 r/min离心15 min；倒掉上清液添加1～2 ml PBS(pH值为6.8)重悬。(2)体液(包括脑脊液、腹腔积液、胸腔积液)：无菌体液可直接接种，标本量>10 ml，以离心半径30 cm，3000 r/min离心15 min，取沉淀物接种；污染标本须同痰液处理方法处理后再接种。(3)组织：用玻璃珠将组织均匀碾碎；取碾磨液至已标记的50 ml离心试管内，加等量的4% NaOH前处理液，振荡20 min，加无菌PBS(pH值为6.8)至约45 ml，盖紧盖子；以离心半径30 cm，3500 r/min离心15 min；倒掉上清液添加1 ml PBS(pH值为6.8)重悬。

2.液体培养法：用OADC[由oleic(亚油酸)、albumin(白蛋白)、dextrose(葡萄糖)、catalase(过氧化氢酶)组成]直接溶解PANTA[由polymixin B(多黏菌素B)、amphotericin B(两性霉素B)、nalidixic acide(奈啶酸)、trimethoprin(甲氧苄氨嘧啶)、azocillin(阿洛西林)组成]，在BBL MGIT培养管中加入0.8 ml混合添加剂，然后接种0.5 ml标本至BBL MGIT培养管中。液体培养基系统每日自动记录荧光信号的变化，从而判定有无分枝杆菌生长。42 d内系统显示阳性，挑取菌液做结核抗原检测，同时继续做药敏试验；如果结核抗原检测为阴性，则挑取菌液涂片做抗酸染色，如果涂片阳性继续做药敏试验；42 d后系统显示阴性，涂片抗酸染色如也为阴性，则结果为“培养42 d，未培养出分枝杆菌”。

3.药敏试验：采用罗氏比例法进行药敏试验。具体操作为：吸取液体培养管中的培养基，充分研磨后，与标准比浊管制成1 mg/ml的菌悬液，稀释100倍制成0.01 mg/ml的菌悬液，再稀释100倍制成10-4mg/ml的菌悬液，用标准接种环分别蘸取1满环0.01 mg/ml的菌悬液和10-4mg/ml的菌悬液，用划线法均匀接种于对照培养基和含药培养基表面。35 ℃～37 ℃培养至少4周报告结果。

三、指标定义

任一耐药：对任意一种及以上抗结核药品(利福平、异烟肼、阿米卡星、乙胺丁醇、莫西沙星、左氧氟沙星、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺和链霉素)耐药；耐多药(MDR)：至少同时对异烟肼和利福平耐药；准广泛耐药(pre-XDR)：在MDR的基础上耐莫西沙星或左氧氟沙星；基线耐药：患者初次治疗时痰液或纤维支气管镜洗液标本经罗氏比例法培养，结果为耐药；经治耐药：患者经反复多次治疗后的痰液或纤维支气管镜洗液标本经罗氏比例法培养，结果为耐药；转化耐药：患者初次治疗时的痰液或纤维支气管镜洗液标本经罗氏比例法培养时结果为敏感，经过反复多次治疗后结果转变为耐药；恢复敏感：患者初次治疗时的痰液或纤维支气管镜洗液标本经罗氏比例法培养时结果为耐药，经过反复多次治疗后结果转变为敏感。初次治疗开始至最后一次治疗开始的平均时间间隔=从收到患者的第一份结核培养标本至末次治疗收到第一份结核培养标本的时间间隔的合计时间/患者例数。

四、统计学处理

采用Graphpad Prism 5.0统计软件进行数据分析。计数资料以“例数”和“百分率(%)”表示，采用χ2检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般情况

44例患者中，男性40例(90.9%)，女性4例(9.1%)；初次治疗时的年龄范围为20～86岁，平均年龄(50.3±18.3)岁；20～30岁10例(22.7%)，31～59岁13例(29.6%)，60～83岁21例(47.7%)；初次治疗开始至最后一次治疗开始的平均时间间隔为(39.3±10.7)个月，其中治疗间隔24～36个月20例，37～48个月15例，49～60个月6例，61～72个月3例；治疗2次28例，3次13例，4次3例。

二、结核病患者耐药情况分析

44例患者中，经反复多次治疗后，患者感染的结核分枝杆菌全敏感菌株减少，任一耐药、耐多药、准广泛耐药、任意4种药品耐药、任意5种药品耐药、任意6种药品耐药和任意7种药品耐药率均出现增加。其中，准广泛耐药率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 44例结核病患者反复多次治疗后结核分枝杆菌耐药变化情况[例(耐药率，%)]

基线时期，44例患者利福平耐药率为20.5%，异烟肼耐药率为31.8%，阿米卡星耐药率为22.7%，左氧氟沙星耐药率为7.9%，对氨基水杨酸耐药率为5.4%，链霉素耐药率为3.1%；无乙胺丁醇、莫西沙星和丙硫异烟胺耐药菌株(表2)；经反复多次治疗后，部分患者的痰液或纤维支气管镜洗液标本由敏感转变为耐药，其中利福平转为耐药9例(20.5%)，异烟肼转为耐药7例(15.9%)，阿米卡星转为耐药6例(13.6%)，乙胺丁醇转为耐药7例(15.9%)，莫西沙星转为耐药5例(12.8%)，左氧氟沙星转为耐药3例(7.9%)，对氨基水杨酸转为耐药2例(5.4%)，丙硫异烟胺转为耐药7例(18.4%)，链霉素转为耐药1例(3.1%)；但也有部分患者由耐药转为敏感，其中利福平恢复敏感1例(2.3%)，异烟肼2例(4.5%)，阿米卡星7例(15.9%)，乙胺丁醇1例(2.3%)，对氨基水杨酸1例(2.7%)。见表2。

表2 44例反复多次治疗结核病患者治疗前后结核分枝杆菌耐药对比情况

与基线菌株比较，经反复多次治疗后，乙胺丁醇、莫西沙星和丙硫异烟胺耐药率差异有统计学意义，利福平、异烟肼、阿米卡星、左氧氟沙星、对氨基水杨酸和链霉素耐药率差异无统计学意义。17例(38.6%)结核病患者耐受药品的种类发生增多现象，其中增多1种8例(18.2%)，增多2种4例(9.1%)，增多3种2例(4.5%)，增多4种2例(4.5%)，增多8种1例(2.3%)。

讨 论

尽管全球结核病的负担在下降，但距离实现终止结核病的目标存在一定的困难。阻碍这一目标实现的原因之一即为耐药结核病，耐药结核病也是临床上关注的重点。患者感染耐药结核分枝杆菌的主要原因有：初次感染时，感染的结核分枝杆菌即为耐药菌；或初次感染时为敏感菌，经过长期用药后，结核分枝杆菌在体内长期进化，转化为耐药结核分枝杆菌[4-5]。我国MDR-TB治愈率较低。Chen等[6]回顾性分析了2014年1月至2016年9月浙江省某结核病定点医院经过标准治疗的所有MDR-TB患者，共纳入治疗失败患者20例和治疗成功患者74例，发现18例(90.0%)治疗失败的患者以原发菌株持续感染为特征，其中14例(77.8%)在治疗无效的情况下发生了表型或基因型获得性耐药。治疗失败患者有效药物数量不超过3种，联合治疗方案中有效药物数量不足是MDR-TB治疗失败的主要原因。所以，临床上应密切关注结核分枝杆菌的耐药问题。

本研究回顾性分析了2013年1月至2020年12月期间苏州大学附属传染病医院反复多次治疗且治疗时间间隔≥2年的结核病患者的资料。药敏试验结果显示：乙胺丁醇、莫西沙星和丙硫异烟胺耐药率均明显升高，差异均有统计学意义。44例患者中，17例患者出现了耐受药物种类增多的现象，5例转变为准广泛耐药结核病。出现结核分枝杆菌对药物的耐药率增高和耐药种类的增多可能与结核病的治疗史有关，用药不规范、自行停药、中断治疗等均会导致结核分枝杆菌产生耐药，随着抗结核治疗时间的延长，结核分枝杆菌发生耐药的概率也会升高。虽然本研究中部分药物的药敏试验存在缺失，数据可能存在一定偏倚，但是仍可以作为参考，在一定程度上反映耐药率的变化情况。

本研究纳入的患者出现多次治疗的原因较多，主要为体内结核分枝杆菌复燃和外源性结核分枝杆菌再感染。一般认为，治疗后结核病患者耐药性的产生是由于治疗不当导致的获得性耐药。也有研究表明，由传播引起的耐药也占据一定比例。Nsofor等[7]对2009—2015年上海市收治肺结核患者的首株和末株结核分枝杆菌进行基因型和全基因组测序，发现外源性再感染引起的原发性耐药是上海地区结核病患者产生耐药的主要原因。此外，Shen等[8]对2000—2012年期间上海地区所有经细菌学确诊的成功治疗的复发或再感染结核病患者进行了回顾性队列研究。研究发现，5.3%(710/13 417)的成功治疗患者出现复发，每1000人年7.55次(95%CI：7.01～8.13)，是普通人群肺结核发病率的18倍以上；在141例有配对分离株的复发患者中，59例(41.8%)有不同的基因型，表明再次感染了不同的菌株。所以，本研究中44例患者出现了多次治疗史的具体原因还要在未来的研究中进一步分析。

综上所述，在结核病的治疗过程中，应密切关注结核分枝杆菌的耐药问题，合理规范用药，有效治疗结核病，并且采取合适的预防和阻断传播措施，以减少耐药结核病的流行。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明宋翌琰：论文撰写、数据整理、统计学分析；郦芳华、李若男、陈洁：数据整理；赵静、郁大伟、宋华峰：药物敏感性试验；徐俊驰、吴敏娟：研究指导；胥萍：研究指导、论文修改。