陕北石油污染土壤微生物种群变化及影响因素

许殷瑞,吴蔓莉,王 丽,高 欢,刘泽梁

陕北石油污染土壤微生物种群变化及影响因素

许殷瑞,吴蔓莉*,王 丽,高 欢,刘泽梁

(西安建筑科技大学,陕西省环境工程重点实验室,西北水资源与环境生态教育部重点实验室,陕西 西安 710055)

采集陕北地区10个产油区县的石油污染土壤和洁净土壤,利用化学分析法和分子生物学技术对土壤理化性质和细菌群落结构进行测定,采用Pearson相关性分析和冗余分析研究石油污染对土壤理化性质、微生物种群分布和多样性的影响.结果表明,与未受污染土壤相比,石油污染土壤的NO3--N、总有机碳、全碳、全硫含量和碳氮比增加,pH值减小;土壤细菌群落均匀度明显降低,丰富度无明显变化.不同地区土壤受到石油污染后,一些优势细菌的相对丰度变化明显.变形菌门()和绿弯菌门()的相对丰度变化与石油烃含量呈显著正相关,的相对丰度变化与石油烃含量呈极显著负相关.定边、靖边、子长、绥德、吴起、安塞和富县石油污染土壤中假单胞菌属()、诺卡氏菌属()、节杆菌属()、不动杆菌属()、、和相对丰度显著增加;定边、靖边、子长和绥德石油污染土壤中、假诺卡氏菌属()、、相对丰度显著降低.假单胞菌属()、诺卡氏菌属()、节杆菌属()和为陕北地区石油污染土壤中的主要“嗜油菌”.土壤pH值、含水率、总石油烃和总有机碳等理化性质是影响陕北油田区石油污染土壤微生物种群结构的关键因素.

石油污染土壤；细菌群落结构；理化性质；影响因素；区域特征

土壤微生物物种是与区域环境长期适应的结果,具有一定的稳定性.当土壤环境发生变化时,土壤微生物群落组成与多样性也随之改变,其中一些微生物对环境变化响应灵敏,可作为土壤质量的生物学监测指标[1-3].

土壤受到石油污染后,微生物菌群结构和多样性发生变化.一些研究认为,石油污染增加了土壤中石油烃降解菌的数量,使土壤微生物群落的丰富度和均匀度降低[4-7].但是,也有研究认为石油污染刺激了土壤中微生物的生长,使土壤微生物多样性呈增加趋势[8].王金成[9]、刘五星[8]等对土壤环境因子与微生物群落结构特征变化的相关性进行了研究,结果表明土壤中总石油烃含量的变化影响了土壤pH值、盐含量、总磷和有机质含量,进而对微生物群落结构和多样性造成影响.

陕北是我国西北地区重要的能源化工基地.近年来,受油田开发的影响,土壤的石油污染问题十分严重.许多文献对陕北石油污染土壤中微生物群落结构组成和多样性进行了相关研究[10-13],但多数研究仅针对某一固定场所的污染情况进行调查,缺少对陕北油田区的全面研究.

本文采集了陕北10个产油区县的石油污染和未污染土壤,对不同区域土壤的理化性质和微生物种群结构进行研究,探讨石油污染对土壤理化性质、微生物种群结构和多样性造成的影响.通过比较同一地区石油污染土壤和洁净土壤中优势细菌的相对丰度,分析了嗜油菌和憎油菌在不同地区的分布情况.研究对于详细了解陕北油田区污染土壤中微生物的分布情况,以及从污染土壤中富集筛选高效石油烃降解菌具有一定的理论意义.

1 材料与方法

1.1 采样点分布及土壤样品采集

于2019年9～10月采样,采样点分布情况如图1所示,分别在陕西省榆林市辖区的定边县、靖边县、绥德县,延安市辖区的宝塔区、吴起县、志丹县、安塞区、子长县、延长县、富县等10个产油区县的油井场周围设置采样点.各采样点基本地形为黄土高原丘陵沟壑区,属典型的温带大陆性半干旱季风气候,土壤类型以黄绵土为主,地理坐标为东经107°49'～110°27',北纬35°59'～37°38'.采集油井口周围受石油污染的表层土壤(0～20cm)作为实验土壤,采集各油井场附近未受污染的表层土壤作为对照土壤(将总石油烃含量低于500mg/kg的土样视作清洁土壤[14]).采集方法为多点取土后混匀,剔除较大的植物根系和砾石等杂质后,装于无菌样品袋中,利用干冰保持低温状态运回实验室,于-80℃下储存备用.各土壤样品编号见表1.

图1 采样点分布

表1 样品名称

1.2 实验方法

1.2.1 土壤理化性质测定 土壤含水率采用烘干称重法测定,pH值采用电极法测定,氧化还原电位采用电位法测定,氨氮采用靛酚蓝比色法测定, NO3--N采用紫外分光光度法测定,总有机碳采用总有机碳分析仪(Vario TOC,Elementar)测定,总石油烃采用超声萃取-重量法测定,全氮、全碳、全硫含量及碳氮比采用元素分析仪(Vario MACRO,Elementar)测定[15-17].对每个土壤样品的理化性质进行3次平行测定.

1.2.2 高通量测序方法 将取自陕北不同地区油井场内的石油污染和未污染土壤样品送至上海生工生物工程股份有限公司进行高通量测序分析.主要分析流程如下:土壤样品经预处理后,利用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取样本总DNA,采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,Qubit定量检测DNA样本浓度;利用341F/805R(341F引物:5’-CCCTACACGACGCTCT- TCCGATCTG-3’;805R引物:5’-GACTGGAGTTC-CTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’)对提取的总DNA进行PCR扩增,实验选择扩增区域为16SV3- V4;利用2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小,Qubit 3.0荧光定量仪进行文库浓度分析后,使用Illumina Miseq平台进行高通量测序.对所得原始数据进行去除引物接头、序列对拼、质量剪切以及剔除嵌合体和非特异性扩增序列等处理;利用Usearch软件将有效序列依据97%的相似度进行操作分类单元(OTU)的划分,并利用R语言绘制Venn图;利用Mothur软件进行Alpha多样性分析;利用RDP classifier贝叶斯算法将OTU代表序列与RDP数据库进行序列比对,从而得到每个OTU的物种注释信息,在门和属分类水平上统计各样品的群落组成.

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 18.0对土壤理化数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)并利用最小显著差数法 (LSD,<0.05)进行多重比较;对油污土壤和洁净土壤理化性质的差值与总石油烃含量的差值进行Pearson相关性分析;对土壤受石油污染后特有OTU数目变化、细菌Alpha多样性变化、优势菌门和菌属相对丰度变化与理化性质变化进行Pearson相关性分析;利用Canoco软件对优势菌门和菌属相对丰度变化与理化性质变化进行冗余分析(RDA).

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

土壤理化性质测定结果见表2.所采集的10个地区土壤样品中,子长(ZC-W)、吴起(WQ-W)、延长(YC-W)、绥德(SD-W)和延安(YA-W)5个地区土壤含油量在4533～6661mg/kg之间;富县(FX-W)、志丹(ZD-W)、靖边(JB-W)和安塞(AS-W)4个地区土壤含油量在12867～50200mg/kg之间;在定边采集的土壤样品(DB-W)含油量高达146500mg/kg.

采集的陕北10个区域未污染土壤含水率在0.090%～14.764%之间;pH值在7.14～8.62之间,呈碱性;氧化还原电位在128～180mV之间,氨氮含量在4.11～58.11mg/kg之间,NO3--N含量在0.28～ 26.82mg/kg之间,总有机碳含量在2034～9068mg/kg之间,全氮、全碳、全硫含量分别在0.2～0.7,13.8～ 19.0,0.09～0.94g/kg之间.不同地区土壤随石油烃含量增加,总有机碳、全碳、全硫含量和碳氮比显著提高.

对10个采样区油污土壤和洁净土壤理化性质的差值(即土壤受石油污染后,各项理化指标的变化量)与总石油烃含量的差值进行相关性分析.结果表明,土壤pH值(=-0.667,=0.035)、NO3--N(=0.890,=0.001)、总有机碳(=0.999,<0.001)、全碳(= 0.989,<0.001)、全硫(=0.845,=0.002)和碳氮比(=0.965,<0.001)的变化与石油烃含量具有显著相关性,其余理化性质变化与石油烃含量间的相关性不显著(>0.05).说明污染使土壤pH值降低, NO3--N、总有机碳、全碳、全硫和碳氮比提高,对含水率、氧化还原电位、氨氮、全氮等理化性质影响较小.

石油是由多种烃类物质和少量沥青、胶质等非烃类物质组成的复杂混合物,其化学组成包括碳(83%～87%)､氢(11%～14%)､硫(0.06%～0.8%)､氧(0.08%～1.82%)等元素[18-20].因此,石油污染后土壤总有机碳、全碳、全硫含量和碳氮比明显增加.有研究认为,石油污染导致土壤盐分的积累,使得土壤细菌及放线菌数量上升,进而引起微生物厌氧降解过程产生的酸性物质增加,使得土壤含水量、pH值及氧化还原电位下降[21-25].大多数能够代谢石油烃的微生物在pH值为7的中性、土壤碳氮比为100/10的条件下活性最强[26-29].陕北地区未受污染的土壤呈碱性,受石油污染后pH值有所降低,碳氮比显著提高,不同地区清洁土壤和污染土壤的碳氮比均高于100/10.相较于其他土壤类型,陕北地区黄绵土氮素含量偏低,石油污染导致土壤中的碳含量大幅增加,进而造成氮素不足.因此,向陕北石油污染土壤中加入氮源进行生物刺激修复理论上是一种可行的生物修复方法.

表2 陕北油田区土壤理化性质

注:平均值±标准误差,=3;同列数字后不同小写字母表示差异显著(<0.05).

2.2 OTUs物种分析

对97%相似度分类的OTUs进行生物信息统计分析,同时绘制Venn图(图2).结果表明各地区未污染土壤样品的OTUs总数为35332,其中共有OTUs数目为97,占各样品OTUs总数的1.71%～12.11%(图2(a));石油污染土壤样品共产生了34029个OTUs,其中共有OTUs数目为99个,占OTUs总数的1.43%～7.78%(图2(b)).受石油污染后,志丹和安塞土壤特有OTU数目增多(与未受污染土壤相比增加值大于200),延长、延安和富县特有OTU数目减少(减小值大于200),其余采样点变化较小.土壤特有OTU数目变化与石油烃含量间未呈现出显著相关关系(>0.05),石油污染未对土壤特有OTU数目造成显著影响.

图2 土壤样品OTU分布Venn图

2.3 Alpha多样性分析

由图3可知,各地区清洁土壤ACE指数和Chao1指数范围分别为1072～8121和986～7949.相比清洁土壤,绥德、吴起和安塞地区石油污染土壤ACE指数(差值为-560～-1634)和Chao1指数(差值为-388～-1711)降低,志丹、靖边、子长和延安地区ACE指数(差值为518～1653)和Chao1指数(差值为190～1570)增加,其余地区变化较小.由以上分析可知,土壤受到石油污染后,细菌菌群的ACE指数和Chao1指数发生变化,但不同地区的变化趋势并不一致.各地区清洁土壤Shannon指数和Simpson指数范围分别为3.69～7.24、0.0024～0.0658.与清洁土壤相比,除子长、绥德和延安以外其余7个地区石油污染土壤Shannon指数降低(差值为-0.05～-1.69), Simpson指数提高(差值为0.001～0.1014),且含油量大的地区变化幅度大于轻度污染地区.

对土壤细菌多样性变化与理化性质变化进行相关性分析(表3).由表3可知,石油烃含量与土壤ACE指数和Chao1指数变化的相关性不显著(> 0.05),与Shannon指数变化呈显著负相关(=0.038), 与Simpson指数变化呈极显著正相关(<0.001).石油污染对土壤细菌群落丰富度无显著影响,但会降低细菌群落均匀度.

杨萌青等[30]研究了不同含油量下土壤微生物群落结构的变化情况,结果表明石油污染会降低土壤菌群的均匀度; Patel等[31]采集了印度不同工业区的油污土壤进行宏基因组DNA提取,以研究微生物群落对石油扰动的耐受能力,结果显示土壤微生物多样性随污染程度的增加而显著降低.本文对陕北石油污染土壤微生物多样性的研究结果与上述文献报道一致.石油进入土壤环境后,部分土著微生物能够利用石油中的碳、氮等组分作为营养物质进行生长代谢,并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物,该微生物类群(即嗜油菌/石油烃降解菌[32-33])数量逐步上升;部分微生物(即憎油菌)因不能适应石油污染后的土壤环境,数量逐渐减少.由此造成土壤微生物群落均匀度呈现降低趋势.

2.4 物种分类学分析

2.4.1 门水平群落结构分析 陕北不同地区未污染土壤中的优势菌门基本一致,主要包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和Candidatus Saccharibacteria等.

与未受污染土壤相比,石油污染土壤中的优势菌门类别基本不变,但其相对丰度变化明显(表4).

将菌门丰度变化值与各环境因子变化值进行相关性分析(表5)发现,变形菌门(Proteobacteria,=0.034)和绿弯菌门(Chloroflexi,=0.045)的相对丰度变化与石油烃含量呈显著正相关,CandidatusSaccharibacteria的相对丰度变化与石油烃含量呈极显著负相关(=0.009),其余菌门的相对丰度变化与石油烃含量的相关性不显著(>0.05).

土壤受到石油污染后,新出现的或相对丰度显著增加的细菌为嗜油菌/石油烃降解菌,相对丰度显著降低的为憎油菌[4,30,34].据此可推测陕北地区土壤中的变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)为嗜油菌门,CandidatusSaccharibacteria为憎油菌门.以优势菌门丰度变化作为物种数据,土壤理化性质变化作为环境变量进行冗余分析(RDA)(图4).根据各环境因子连线的长度可知,在所有环境因子中,总石油烃(与RDA1的相关系数为-0.544,与RDA2的相关系数为-0.839)、总有机碳(与RDA1的相关系数为-0.569,与RDA2的相关系数为-0.823)和总碳(与RDA1的相关系数为-0.513,与RDA2的相关系数为-0.858)对土壤细菌在门水平的群落结构变化影响最大,其次为pH值(与RDA1的相关系数为0.655,与RDA2的相关系数为0.756)、含水率(与RDA1的相关系数为-0.959,与RDA2的相关系数为0.282)和NO3--N (与RDA1的相关系数为-0.359,与RDA2的相关系数为-0.933).结合相关性分析(表5),随总石油烃、总有机碳和总碳含量增大,变形菌门(Proteobacteria)丰度增加,CandidatusSaccharibacteria和绿弯菌门(Chloroflexi)丰度减小;随pH值增大,CandidatusSaccharibacteria丰度增加,变形菌门(Proteobacteria)丰度减小;随含水率增大,变形菌门(Proteobacteria)丰度增加,放线菌门(Actinobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度减小;随NO3--N含量增大,CandidatusSaccharibacteria丰度减小.

2.4.2 属水平群落结构分析 陕北不同地区洁净土壤中的优势菌属主要包括假单胞菌属()、、鞘氨醇单胞菌属()、诺卡氏菌属()、海杆菌属()、芽单胞菌属()、节杆菌属()、不动杆菌属()等.

图3 土壤细菌的alpha多样性指数

表3 土壤细菌多样性变化与理化性质变化的相关性分析

注:*、**分别表示在0.05水平(双侧)和0.01水平(双侧)上显著相关.

由表6可知,假单胞菌属()在定边、靖边和安塞污染土壤中显著增加;在定边和绥德污染土壤中显著减少,在吴起显著增加;诺卡氏菌属()在靖边显著减少,在子长和绥德显著增加;海杆菌属()在绥德显著减少,在靖边显著增加;节杆菌属()在子长和绥德显著增加;不动杆菌属()、分枝杆菌属()分别在安塞、定边和吴起显著增加,其中为靖边、子长和吴起油污土壤中的新出现菌属;和在富县显著增加;假诺卡氏菌属()和在靖边和子长显著减少;其余菌属的相对丰度变化较小.总体上,假单胞菌属()、诺卡氏菌属()、节杆菌属()和在多数油污土壤中丰度显著增加.

根据菌属丰度变化与环境因子变化的相关性分析结果(表7),假单胞菌属(,=0.043) 和(<0.001)的相对丰度变化与石油烃含量呈显著正相关,___(=0.009)、鞘氨醇单胞菌属(,=0.034)、分枝杆菌属(,=0.031)和假诺卡氏菌属(,=0.048)的相对丰度变化与石油烃含量呈显著负相关,其余菌属的相对丰度变化与石油烃含量的相关性不显著(>0.05).

表4 土壤受石油污染后各细菌菌门相对丰度变化

注:表中数据为各地区石油污染土壤与未污染土壤相应菌门丰度的差值,单位为%;“—”表示未发生明显变化.

表5 土壤受石油污染后菌门丰度变化与理化性质变化间的相关性

注:*、**分别表示在0.05水平(双侧)和0.01水平(双侧)上显著相关.

假单胞菌属()[35-36]、节杆菌属()[37-38]、不动杆菌属()[39-40]和[41-42]是文献中报道的石油烃降解菌.相关性分析结果表明(表7),随总有机碳、总石油烃、全碳和全硫含量增大,假单胞菌属()和丰度增加，和假诺卡氏菌属()丰度减小;随pH值增大，和分枝杆菌属()丰度增加.说明陕北石油污染土壤中的嗜油菌属主要包括假单胞菌属()、诺卡氏菌属()、节杆菌属()、不动杆菌属()、、和;憎油菌属为、假诺卡氏菌属()、、_ g.

表6 土壤受石油污染后各细菌菌属相对丰度变化

注:表中数据为各地区石油污染土壤与未污染土壤相应菌属丰度的差值,单位为%;“—”表示未发生明显变化.

表7 土壤受石油污染后菌属丰度变化与理化性质变化间的相关性

注:*、**分别表示在0.05水平(双侧)和0.01水平(双侧)上显著相关.

图4 土壤细菌群落结构变化与环境因子变化间的冗余分析(RDA)

MC:含水率;ORP:氧化还原电位;AN:氨氮含量;NN:NO3--N含量;TOC:总有机碳含量;TPH:总石油烃含量;TC:全碳含量;TS:全碳含量

3 结论

3.1 陕北油田区土壤受石油污染后,NO3--N (= 0.890,=0.001)、总有机碳(=0.999,<0.001)、全碳(=0.989,<0.001)、全硫(=0.845,=0.002)和碳氮比(=0.965,<0.001)显著提高,与石油烃含量呈显著正相关;pH值(=-0.667,=0.035)显著降低,与石油烃含量呈显著负相关;石油污染对土壤细菌群落丰富度无显著影响,但会降低细菌群落均匀度(油污土壤与洁净土壤的Shannon指数和Simpson指数差值与石油烃含量的相关性系数分别为-0.659和0.929).

3.2 陕北地区土壤中的嗜油菌在门水平上主要包括变形菌门()和绿弯菌门(),在属水平上主要包括假单胞菌属()、诺卡氏菌属()、节杆菌属()、不动杆菌属()、、和;憎油菌在门水平上为门,在属水平上主要包括假诺卡氏菌属()、、___.

3.3 影响陕北油田区土壤优势菌门生长的限制性因子主要为总石油烃、总有机碳和总碳,其次为pH值、含水率和NO3--N,受影响的菌门为变形菌门()、放线菌门()、、芽单胞菌门()和绿弯菌门();影响优势菌属生长的限制性因子主要为含水率、总有机碳和总石油烃,其次为全碳、全硫和pH值,受影响的菌属主要包括假单胞菌属()、___鞘氨醇单胞菌属()、分枝杆菌属()和假诺卡氏菌属()等.

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The influences of petroleum pollution on the microbial population distribution in Northern Shaanxi Province of China.

XU Yin-rui, WU Man-li*, WANG Li, GAO Huan, LIU Ze-liang

(Key Laboratory of Northwest Water Resources and Environment, Ministry of Education, Shaanxi Key Laboratory of Environmental Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China)., 2021,41(9)：4349～4359

Oil-contaminated soil and uncontaminated soil from oil well sites in ten oil-producing counties in Northern Shaanxi were collected. Chemical analysis and molecular biology techniques were used to determine the physicochemical properties and bacterial community structure of soil. Methods such as Pearson correlation analysis and redundancy analysis were used to study the impact of oil pollution on physicochemical properties, microbial population distribution and diversity of soil. Results showed that compared with uncontaminated soil, nitrate-nitrogen, total organic carbon, total carbon, total sulfur and carbon-nitrogen ratio of oil-contaminated soil increased, while the pH value decreased. The richness of soil bacterial community did not change significantly, but the evenness decreased significantly. The relative abundance of some dominant bacterial changed obviously after oil contamination in different regions. Changes in relative abundance of Proteobacteria and Chloroflexi were significantly positively correlated with petroleum hydrocarbon content, and changes in relative abundance of Candidatus Saccharibacteria were significantly negatively correlated with petroleum hydrocarbon content. The relative abundance of,,,,,andincreased significantly in Dingbian, Jingbian, Zichang, Suide, Wuqi, Ansai and Fuxian. The relative abundance of,,, and___decreased significantly in Dingbian, Jingbian, Zichang and Suide.,,andwere the main oilphilic bacteria in Northern Shaanxi Province. Physicochemical properties such as pH, moisture content, total petroleum hydrocarbon and total organic carbon were the key factors affecting the microbial population structure of oil-contaminated soil in Northern Shaanxi oilfield.

petroleum contaminated soil；bacterial community structure；physicochemical properties；influencing factors；regional characteristics

X172,X53

A

1000-6923(2021)09-4349-11

许殷瑞(1995-),女,陕西榆林人,硕士,主要从事石油污染土壤的生物修复研究.

2021-01-20

国家自然科学基金资助项目(52070154,21577109)

* 责任作者, 教授, wumanli@xauat.edu.cn