杧果RAV基因家族的全基因组分析

孙宇 刘志鑫 叶子 罗睿雄 刘晓妹 蒲金基 张贺

摘要： 為了揭示RAV家族基因在杧果中的序列特征及其表达特性，采用生物信息学方法对杧果RAV家族基因进行序列分析，并通过qRT-PCR技术研究杧果胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染过程中该家族基因的相对表达量。结果表明，从杧果基因组中鉴定出6个RAV基因家族成员，其编码的蛋白质均具有AP2和B3超家族保守域结构，命名为MiRAV1～MiRAV6。MiRAV1和MiRAV5为不稳定亲水碱性蛋白质，MiRAV2和MiRAV3为不稳定亲水酸性蛋白质，MiRAV4为稳定亲水酸性蛋白质，MiRAV6为稳定亲水碱性蛋白质。杧果RAV基因编码的蛋白质主要定位于细胞核中，无规则卷曲和α-螺旋是6个MiRAVs蛋白二级结构的主要元件。系统进化树结合基序分析结果表明，在杧果与拟南芥、烟草、苹果、菠萝和毛果杨中，RAV家族基因具有多样性，在进化上结构具有保守性。qRT-PCR结果显示，胶孢炭疽菌侵染过程中，杧果RAV基因的相对表达量均显著下调;细菌性黑斑病菌侵染过程中，MiRAV1～ MiRAV6的相对表达量在3 h时均显著下调，MiRAV1、MiRAV2、MiRAV3和MiRAV6的相对表达量在6 h时均显著上调，MiRAV1、MiRAV5和MiRAV6的相对表达量分别在12 h、24 h、48 h、72 h时均显著上调。以上发现将为研究杧果RAV基因家族成员的功能和作用机制奠定基础。

关键词： 杧果;RAV基因家族;全基因组鉴定;表达分析

中图分类号： S667.7   文献标识码： A   文章编号： 1000-4440（2021）04-0957-11

Genome-wide analysis of the RAV gene family in mango

SUN Yu1，2， LIU Zhi-xin2， YE Zi1，2， LUO Rui-xiong3， LIU Xiao-mei1，2， PU Jin-ji1，2， ZHANG He1，2

（1.College of Plant Protection， Hainan University， Haikou 570228， China;2.Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou 571101， China;3.Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）

Abstract： In order to reveal the sequence and expression characteristics of RAV gene in Mangifera indica， the sequence of the RAV gene family was analyzed using bioinformatics methods， and the relative expression level of RAV gene family was studied by qRT-PCR during the infection of Colletotrichum gloeosporioides and Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae. The results showed that six RAV gene family members were identified from the mango genome， and the encoded proteins had the conserved domains of the AP2 and B3 superfamily， named MiRAV1-MiRAV6. MiRAV1 and MiRAV5 were unstable hydrophilic basic proteins， MiRAV2 and MiRAV3 were unstable hydrophilic acidic proteins， MiRAV4 was a stable hydrophilic acidic protein， and MiRAV6 was a stable hydrophilic basic protein. The proteins encoded by RAV gene of mango were mainly located in the nucleus， and random coil and α-helix were the main elements of secondary structure of six MiRAVs proteins. Phylogenetic tree construction combined with motif analysis showed that， among mango and Arabidopsis thaliana， tobacco， apple， pineapple and Populus tomentosa， the RAV family genes were diverse and their structure was conservative in evolution. The results of qRT-PCR indicated that the relative expression of RAV gene in mango was significantly down regulated during the infection of Colletotrichum gloeosporioides. During the infection of Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae， the relative expression levels of MiRAV1-MiRAV6 were significantly down regulated at 3 h， and the relative expression levels of MiRAV1， MiRAV2， MiRAV3 and MiRAV6 were significantly up-regulated at 6 h， and the relative expression levels of MiRAV1， MiRAV5 and MiRAV6 were significantly up-regulated at 12 h， 24 h， 48 h and 72 h， respectively. These results will lay a foundation for further study on the function and mechanism of RAV gene family members in mango.

Key words： mango;RAV gene family;genomic identification;expression analysis

转录因子，又称反式作用因子，其具有特殊的结构可调控基因表达，是植物中重要的调控因子。植物转录因子在胁迫反应中，对调控基因表达发挥重要作用[1-3]，当植物受到逆境胁迫时，转录因子与相应的顺式作用元件结合，可以调控下游相关基因的表达 [4]。RAV（Related to AB13/VP1）转录因子广泛存在于植物中，该家族同时具有2个保守结构域[5-8]：位于N端，可与GCC-box区域特异性结合的AP2结构域;位于C端，可与CACCTG序列特异性结合的B3结构域[9]。VP1/ABI3以及ARFs转录因子家族都具有该结构域，主要调控植物对生长素和脱落酸的反应[10]。RAV属于AP2/ERF家族的一个亚家族，该家族还包含ERF、AP2、DREB亚家族[11]。

迄今为止，RAV基因家族成员已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[12-13]、黄瓜（Cucumis sativus）[14]、棉花（Gossypium）[15]、东方山羊豆（Galega orientalis）[16]、烟草（Nicotiana tabacum）[17]、茶树（Camellia sinensis）[18]等植物中被陆续克隆和鉴定。例如：在拟南芥中发现7个RAV基因家族成员AtRAV1～AtRAV7，AtRAV1和AtRAV2在拟南芥中参与应对外界胁迫和叶片衰老 [12-13];黄瓜中CsRAV在各个组织中均有表达[14];棉花中GhRAV表达受黄萎病菌的诱导[15];东方山羊豆中GoRAV表达不仅受低温和聚乙二醇的诱导，还受茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸的诱导[16];烟草中GmRAV过量表达会导致叶片失绿，同时抑制植株的生长 [17];茶树中CsRAV表达受NaCl、乙烯和低温的诱导[18]。RAV基因广泛的分布表明它们在植物的生长发育和抗逆反应调控过程中起着非常重要的作用。

杧果（Mangifera indica），被称为热带水果之王，是热带地区重要的果树，也是农民脱贫致富的“金杧果”和“致富树”。随着2020年杧果全基因组测序的完成 [19]，杧果基因功能的研究进程明显加快，然而目前国内外对杧果RAV基因家族的研究还未见报道。为此，本研究对杧果RAV基因家族成员的序列特征及其表达特性进行分析，为杧果基因功能的分析以及杧果的遗传育种等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 杧果生物胁迫处理

杧果嫁接苗由农业农村部儋州杧果种质资源圃提供，品种为贵妃杧。将株高约60 cm，均匀一致，树龄1年的杧果嫁接苗移栽到花盆内，以室温25 ℃，相对湿度70%～90%，光周期12 h（光）/12 h（暗）的条件下进行生物胁迫处理。设置胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌 2个处理，每个处理3株苗，处理0 h作为对照。以分生孢子含量为1 ml 2×106 个的胶孢炭疽菌分生孢子悬浮液、含量为2×107CFU 的细菌性黑斑病菌悬浮液分别对杧果嫁接苗叶片均匀喷雾，取样时间分別为0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，将杧果叶片剪碎，液氮速冻，-80 ℃保存待用。

1.2 杧果全基因组数据的来源

杧果全基因组数据来源于NCBI（PRJNA487154），拟南芥、烟草、苹果（Malus domestica）、菠萝（Ananas comosus）、毛果杨（Populus trichocarpa）5个物种的基因组和RAV基因信息分别来源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）数据库。

1.3 杧果RAV基因家族成员的鉴定

从拟南芥数据库获取AtRAV1～AtRAV7氨基酸序列，并将其作为查询对象在杧果基因组数据库中执行Blastp比较（E≤10-10）。使用Pfam工具（http：//pfam.xfam.org/）检测得到的杧果蛋白质氨基酸序列结构域，进一步去除没有典型AP2和B3结构域的蛋白质氨基酸序列，最终得到所有杧果RAV基因家族成员[20]。其他5个物种中的RAV基因家族成员采用类似的方法进行筛选。

1.4 杧果RAV基因家族的生物信息学分析

通过在线工具ProtParam预测RAV相对分子质量、等电点、外显子数、脂溶指数、氨基酸数等理化性质[21];利用PSORT在线软件进行亚细胞定位预测;通过SOPMA在线软件预测蛋白质的二级结构;利用NCBI Conserved Domain Search预测RAV的保守结构域，再通过SWISS-MODEL在线工具对蛋白质保守域的三级结构进行预测;利用MEME在线软件对杧果RAV家族的蛋白质保守基序进行分析[22]，再通过DNAMAN 6.0软件进行高同源蛋白的氨基酸序列比对。

1.5 系统进化树分析

利用ClustalW程序对杧果和拟南芥、烟草、苹果、菠萝、毛果杨的RAV家族成员的氨基酸序列进行多序列比对。获得RAV蛋白氨基酸序列后使用MEGA 7.0软件，通过邻近法构建进化树，其中校验参数Bootstrap值设置为1 000次重复[23]。

1.6 RNA提取及cDNA合成

杧果叶片总RNA提取参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司产品）说明书中的方法。利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成第1链cDNA [24]。

1.7 杧果RAV基因家族表达分析

利用 QuantStudio 6 Flex的实时荧光定量PCR检测系统检测胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染下杧果RAV家族基因的表达量，引物见表1。反应体系为18.0 μl，设置2个复孔。反应程序参照UltraSYBR Mixture试剂盒说明书（北京康为世纪生物科技有限公司产品）进行设置。以杧果MiActin作为内参基因，0 h的表达量为对照，运用2-△△Ct法进行数据统计，确定MiRAV1～MiRAV6的相对表达量[25]，并通过HemI 1.0.3.7软件绘制热图，其中设置胶孢炭疽菌相对表达量热图参数（条形图的数量）为11，小数点位数值为2，最小值为-20，阶跃值为2;设置细菌性黑斑病菌相对表达量热图参数（条形图的数量）为11，小数点位数值为2，最小值为-2，阶跃值为2。整个表达矩阵每个值进行对数转化，底数为2。

2 结果与分析

2.1 全基因组水平鉴定杧果RAV基因家族成员

在杧果基因组数据库中进行Blastp检索，发现杧果RAV基因家族有6个成员，分别命名为MiRAV1～MiRAV6。通过生物学在线分析工具ProtParam對杧果RAV基因家族6个成员MiRAV1～MiRAV6编码的蛋白质氨基酸序列的理化性质进行了分析，结果（表2）表明，6个MiRAVs蛋白相对分子质量为32 523 340～44 122 280，蛋白质等电点为5.83～9.34，外显子数均为2，脂溶指数为58.93～74.31，氨基酸数为281～392个，不稳定指数为34.14～46.61，亲水性平均数为-0.506～-0.863。因此，预测这6个MiRAVs蛋白中MiRAV1和MiRAV5为不稳定亲水碱性蛋白质，MiRAV2～MiRAV3为不稳定亲水酸性蛋白质，MiRAV4为稳定亲水酸性蛋白质，MiRAV6为稳定亲水碱性蛋白质。

对杧果RAV家族成员进行亚细胞定位预测，结果（表3）显示，它们主要定位于细胞核中，其次定位于叶绿体和细胞质中，推断该家族成员主要存在于进行光合作用的器官中。其中，只有MiRAV1和MiRAV4没有定位于叶绿体，MiRAV4和MiRAV6没有定位于细胞质，线粒体、过氧化氢酶体，质膜定位的MiRAVs成员最少。

通过SOPMA在线软件对MiRAV1～MiRAV6蛋白进行二级结构预测。如图1所示，6个MiRAVs蛋白无规则卷曲结构占比为44.58%～54.85%，α-螺旋结构占比为21.88%～31.67%，延伸链结构占比为16.86%～19.13%，β-转角结构占比为4.85%～7.56%。因此，预测无规则卷曲和α-螺旋是6个MiRAVs蛋白二级结构的主要元件，其次是延伸链和β-转角。

通过NCBI Conserved Domain Search对杧果RAV家族蛋白质氨基酸序列进行保守结构域分析，发现MiRAV1～MiRAV6蛋白均含有AP2和B3超家族保守域（图2）。6个MiRAVs蛋白AP2超家族保守域位置介于18～124;B3超家族保守域位置介于137～291。基于同源建模原理，通过SWISS-MODEL软件对杧果RAV蛋白的2个保守结构域（AP2、B3）三级结构进行预测，发现在AP2保守结构域中，含有1个 α-螺旋和3个反向平行的β-转角;B3保守结构域中，含有1个α-螺旋、2个反向平行的β-折叠和延伸链。

2.2 杧果RAV蛋白系统进化树分析

为了更好地了解杧果RAV基因家族的系统发育关系，将杧果（6个）、拟南芥（7个）、烟草（5个）、苹果（11个）、菠萝（2个）、毛果杨（5个）RAV基因编码的蛋白质氨基酸序列通过Blast工具进行蛋白质氨基酸序列分析，利用ClustalW程序和MEGA 7.0软件构建6个杧果RAV蛋白与其他物种（共5种）植物RAV蛋白系统进化树（图3），将36个RAV成员分成3个分支（Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ），结果显示，6个物种的RAV蛋白家族成员相互嵌合在一起，表明植物RAV在进化过程中相对保守。每个分支中均存在2个杧果RAV成员，其中，Class Ⅰ包含杧果2个、拟南芥2个、毛果杨3个、苹果5个和烟草1个;Class Ⅱ包含杧果2个、苹果4个、菠萝2个和拟南芥5个;Class Ⅲ包含杧果2个、毛果杨2个、烟草4个和苹果2个。在36个RAV成员中，MiRAV1、MiRAV6分别与MDP0000128924、MDP0000939633亲缘关系最近，MiRAV2、MiRAV3分别与AtRAV1、AtRAV7亲缘关系最近，MiRAV4与MDP0000207722、MDP0000485280亲缘关系最近，MiRAV5与Potri.018G109200.1、Potri.018G109200.2亲缘关系最近。因此，推测RAV家族蛋白质不仅具有多样性，对于亲缘关系较近的蛋白质，它们还具有相似或相近的生物学功能。

2.3 杧果RAV家族蛋白质motif和保守结构域分析

基于在线软件MEME对杧果、拟南芥、烟草、苹果、菠萝、毛果杨RAV转录因子家族的蛋白质保守基序进行分析（图4），在RAV转录因子家族中鉴定出5个保守基序，主要的保守基序有4个（motif1～motif4），N端均存在保守的motif1，C端均存在保守的motif2。其中，MiRAV4～MiRAV5、AtRAV3～AtRAV4、MDP0000526584、MDP0000534780、MDP0000165802、MDP0000207722、MDP0000485280、Potri.018G109200.1、Potri.018G109200.2、Potri.003G212800.1、XP_016492322.1不含有motif5。通过基序分析发现，RAV基因家族在进化上结构具有保守性。

通过DNAMAN 6.0软件对杧果6个RAV蛋白和拟南芥7个、烟草5个、苹果11个、菠萝2个、毛果杨5个RAV蛋白进行多序列比对。结果（图5）发现，MiRAV1～MiRAV6与5个物种的RAV转录因子家族存在2个相似的保守域A和保守域B，保守域A与motif1 基本重叠，保守域B与 motif2、motif3 基本重叠。因此，可以推测motif1、motif2和motif3是构成AP2、B3结构域的主要结构。

2.4 杧果RAV基因家族的胁迫响应

以杧果MiActin作为内参基因，0 h处理作为对照，利用qRT-PCR检测并分析了2种病原菌侵染过程中杧果RAV家族基因的表达程度。qRT-PCR结果显示，MiRAV1～MiRAV6和内参基因MiActin的熔解曲线为单峰，熔解温度分别为81.69 ℃、74.15 ℃、71.79 ℃、73.75 ℃、77.79 ℃、80.52 ℃、83.73 ℃，将qRT-PCR产物经2%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果（图6）显示，目标条带单一，清晰，与预计大小一致，说明所设计的引物具有特异性;杧果胶孢炭疽菌侵染过程中（图7A），MiRAV1～MiRAV6的相对表达量均显著下调，其中MiRAV1～MiRAV6相对表达量在6 h时达到最低值，MiRAV1～MiRAV5的相对表达量在72 h时达到最高值，MiRAV6的相对表达量在48 h时达到最高值;杧果细菌性黑斑病菌侵染过程中（图7B），MiRAV1～ MiRAV6的相对表达量在3 h时均显著下调，MiRAV1、MiRAV2、MiRAV3和 MiRAV6的相对表达量在6 h时显著上调，MiRAV1、MiRAV5和 MiRAV6的相对表达量分别在12 h、24 h、48 h、72 h时均显著上调。结果表明，在不同病原菌侵染过程中，MiRAV1～ MiRAV6的相对表达量与对照差异显著。

3 讨论

基因组测序技术的提高和分子生物学研究的深入，为植物基因家族的鉴定、功能基因的挖掘提供了基础，大量植物全基因组已经被成功测序。RAV家族是一类植物特异的转录因子，广泛存在于植物细胞内。在拟南芥[12-13]、黄瓜[14]、棉花[15]、东方山羊豆[16]、烟草[17]、茶树[18]等中关于RAV已开展相应研究，主要体现在参与应对外界胁迫和叶片衰老等方面功能，但关于其杧果RAV转录因子家族的研究至今仍未见报道。

本研究在杧果全基因组水平鉴定到6个RAV基因，理化性质分析结果表明，MiRAV1和MiRAV5为不稳定亲水碱性蛋白质，MiRAV2和MiRAV3為不稳定亲水酸性蛋白质，MiRAV4为稳定亲水酸性蛋白质，MiRAV6为稳定亲水碱性蛋白质。杧果RAV蛋白主要存在于细胞核中，无规则卷曲和α-螺旋是6个MiRAVs蛋白二级结构的主要元件，均具有AP2和B3超家族保守域结构，AP2保守域三级结构含有1个 α-螺旋和3个反向平行的β-转角，B3保守域三级结构含有1个 α-螺旋、2个反向平行的 β-折叠和延伸链，据此推断它们在调控生物性状上存在协同作用。杧果与拟南芥、烟草、苹果、菠萝、毛果杨RAV蛋白家族构建系统进化树结合基序分析结果显示，6个物种的RAV蛋白家族成员相互嵌合在一起，表明植物RAV基因在进化过程中相对保守;在模式植物拟南芥中参与应对外界胁迫和叶片衰老的基因AtRAV1和AtRAV2被聚类到ClassⅡ中，因此，推断该ClassⅡ分支下的杧果MiRAV2和MiRAV3基因可能与应对外界胁迫和叶片衰老有关[12-13];对于亲缘关系较近的蛋白质，推断它们还具有相似或相近的生物学功能;杧果RAV蛋白主要的保守基序有4个（motif1～ motif 4），N端均存在保守的motif1，C端均存在保守的motif2，motif1～ motif 3与卢合均等[15]研究棉花时所鉴定到的motif1～motif3基本一致，motif1与韩林贺等[26]研究普通烟草时所鉴定到的motif1基本一致;杧果与其他5个物种RAV蛋白进行多序列比对结果显示，存在2个明显的保守域A和保守域B，保守域A与motif1基本重叠，保守域B与motif2、motif3基本重叠，因此，可以推测motif1是构成AP2的主要结构，motif2和motif3是构成B3的主要结构。

中国杧果病害危害严重，常见的病害有炭疽病、细菌性黑斑病、白粉病、蒂腐病、疮痂病等[27-28]，其中，杧果胶孢炭疽病与细菌性黑斑病为害杧果最为严重[29-30]。为了解杧果RAV基因在胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌侵染下相对表达量的变化，对杧果叶片进行胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌生物胁迫处理，并通过qRT-PCR技术研究胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌侵染过程中杧果RAV家族基因的相对表达量。结果显示，在不同病原菌侵染过程中，MiRAV1～MiRAV6的相对表达量与对照差异显著，表明MiRAV1～MiRAV6对生物胁迫有响应。RAV基因家族的表达分析研究，更多集中在MeJA[16]、NaCl[18]、ABA和低温[26]等非生物胁迫上，也有前人在研究中提到RAV基因对棉花黄萎病菌[15]、番茄青枯病菌[31]等生物胁迫的响应，本研究通过对杧果接种胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌后的分析，发现了此家族的部分成员在胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌侵染植株之后出现上调表达的现象， 表明RAV基因可能在杧果提高抗炭疽病和细菌性黑斑病的能力方面起着积极作用，如MiRAV1、MiRAV5、MiRAV6在细菌性黑斑病菌侵染后的12～72 h显著上调表达，可以作为后续研究杧果抗细菌性黑斑病机制的候选基因，这也在分子水平上拓宽了杧果响应生物胁迫的机制。

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（责任编辑：陈海霞）

收稿日期：2020-11-25

基金项目：国家重点研发专项（2019YFD1000504）;中国热带农业科学院基本科研业务费专项（1630042017019）

作者简介：孙 宇（1995-），男，海南三亚人，硕士研究生，研究方向为植物保护。（E-mail）sunyuqp@qq.com

通讯作者：张 贺，（E-mail）atzzhef@163.com;蒲金基，（E-mail）cataspjj@163.com