血清miR-219水平与急性缺血性脑卒中后轻度认知功能障碍的关系

李雪媛，常 红，邢惠娟，刘晓琳

辽宁省大连市第三人民医院神经内科一病房，辽宁大连 116033

急性缺血性脑卒中(AIS)是最常见的卒中类型，占我国脑卒中的69.6%～70.8%[1]。轻度认知功能障碍是介于正常衰老和痴呆(AD)之间的一种中间状态，其发病率随年龄增长而升高[2]。AIS常伴有认知功能障碍甚至痴呆。miRNAs是一类由内源基因编码的由22～25个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA，在体内发挥多种生物学功能，可作为进行性疾病诊断与预后判断的重要生物标志物。研究表明，miRNAs与AIS患者认知功能障碍严重程度有关[3]。miR-219是一种常见的miRNAs，研究表明，肾脏纤维化患者血清中 miR-219 水平明显降低[4]。miR-219在AIS患者中的研究报道不多，本研究采用实时荧光定量PCR检测185例AIS患者血清中miR-219 情况，探讨miR-219与AIS患者轻度认知功能障碍的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年11月至2019年10月在本院神经内科住院的185例AIS患者为研究对象，其中男100例，女85例；年龄46～69岁，平均(55.6±7.9)岁。AIS患者按照认知功能评价分为轻度认知功能障碍组和无认知功能障碍组。纳入标准：(1)符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[1]中AIS的诊断标准；(2)发病至入院就诊时间<24 h；(3)进行1.5T或3.0MRI检查；(4)患者自愿参与本研究，并签署知情同意书，能完成临床记录者。排除标准:(1)有重度认知功能障碍；(2)合并其他心血管疾病；(3)有恶性肿瘤；(4)临床资料不全。另选取体检健康者170例作为对照组，其中男92例，女78例；年龄46～69岁，平均(60.1±8.8)岁。

1.2仪器与试剂 Trizol 抽提试剂盒购自美国 Invitrogen 公司；反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix购自南京Vazyme生物科技股份有限公司；miR-219及U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计与合成。实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 血清样品：采集AIS患者与健康体检者空腹静脉血5 mL，常温3 000 ×g离心10 min后收集血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2认知功能的判断 由神经科医生对所有研究对象进行认知功能评价。轻度认知功能障碍判断标准：参考田金洲主编的《中国痴呆诊疗指南(2017年)》中有关轻度认知障碍的诊断标准，并运用简易精神状态检查表(MMSE)、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)[5]、日常生活功能量表(ADL)等进行认知功能测评。根据认知功能评价将AIS患者分为轻度认知功能障碍组和无认知功能障碍组。

1.3.3实时荧光定量PCR检测血清miR-219 水平 采用 Trizol抽提试剂盒提取血清中总RNA,采用反转录试剂盒获得cDNA。采用实时荧光定量PCR检测各组研究对象血清中miR-219 水平。采用实时荧光定量PCR仪对miR-219进行扩增。miR-219正向引物：5′-CCGCCCCGGGCCGCGGCUCC-3′，反向引物：5′-GCCCCCAAACCUCGAGCGGG-3′；内参U6正向引物：5′-GCAGTGCTTAGCTGGTTGT-3′，反向引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′。实时荧光定量PCR反应体系共20 μL：AceQ qPCR SYBR®Green Mix 8 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃ 45 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法对血清miR-219水平进行定量分析，重复3次取平均值。

1.3.4其他临床资料收集 对所有研究对象进行三酰甘油(TG)、总胆固醇 (TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)检测，并收集高血压病史、饮酒史、吸烟史等临床资料。中国缺血性脑卒中亚型(CISS)分型参考文献[6]。

2 结 果

2.1各组研究对象一般情况比较 185例AIS患者中有轻度认知功能障碍95例，无认知功能障碍组90例。轻度认知功能障碍组中糖尿病比例明显高于无认知功能障碍组，差异有统计学意义(P<0.05)；轻度认知功能障碍组和无认知功能障碍组性别，年龄，有吸烟、饮酒史比例，有高血压、冠心病、脑卒中、心肌梗死基础疾病比例，CISS 分型比例比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组研究对象一般情况比较

组别n基础疾病[n(%)]高血压糖尿病冠心病脑卒中心肌梗死CISS分型[n(%)]大动脉粥样硬化心源性卒中穿支动脉病变其他原因不明原因有轻度认知功能障碍组9554(56.8)40(42.1)32(33.7)28(29.5)7(7.4)55(57.9)15(15.8)17(17.9)6(6.3)2(2.1)无认知功能障碍组9042(46.7)25(32.2)23(25.6)21(23.3)3(3.3)50(55.6)16(17.8)21(23.3)2(2.2)1(1.1)对照组170——————————χ2/F1.9174.1631.4620.8981.4722.892P0.1660.0410.2270.3440.2250.576

2.2各组研究对象血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、miR-219 水平比较 轻度认知功能障碍组、无认知功能障碍组血清中miR-219水平明显高于对照组，且轻度认知功能障碍组血清中miR-219 水平明显高于无认知功能障碍组，差异有统计学意义(P<0.05)，而3组间血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组研究对象血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、miR-219 水平比较

2.3AIS患者发生轻度认知功能障碍的影响因素分析 将单因素分析中P<0.2的变量进一步纳入二分类Logistic回归分析，结果显示，糖尿病、血清miR-219水平高是AIS患者发生轻度认知功能障碍的独立危险因素，见表3。

表3 AIS患者发生轻度认知功能障碍的影响因素分析

2.4血清miR-219水平对AIS患者发生轻度认知功能障碍的预测价值 血清miR-219水平预测AIS患者发生轻度认知功能障碍的ROC曲线下面积为0.818(95%CI：0.755～0.871)，最佳截断值为1.34，灵敏度为68.42%，特异度为82.22%，见图1。

图1 血清miR-219水平预测AIS患者发生轻度认知功能障碍的ROC曲线分析

3 讨 论

AIS患者认知功能障碍主要与血管闭塞或血流量减少导致脑细胞缺乏氧气和营养有关。AIS患者认知功能障碍是受多基因调控的过程，涉及多种信号转导途径、多种细胞因子的变化[7-8]。miRNAs 是一类真核生物内源性小分子单链 RNA，通过与靶基因mRNA的3′端非编码区特异性结合，参与神经系统不同信号通路基因调控，在学习与记忆功能中起重要作用，也用于血管性痴呆患者早期诊断[9]。袁梅等[10]研究结果表明，AIS 患者血清 miR-335水平明显下降，与脑卒中后患者病情密切相关。谢尊椿等[11]研究表明，AIS患者血浆miR-124水平明显降低，其水平与脑梗死面积及美国国立卫生研究所脑卒中评分(NIHSS)呈负相关。由此可见，多种miRNAs与AIS病情进展有关。

miR-219是常见的miRNA之一，广泛存在于各种细胞、组织中。多项研究表明，miR-219在多种病变组织、肿瘤中均异常表达，参与多种信号通路，进而抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，可作为多种疾病早期诊断、治疗靶点或预后监测的指标[12-13]。本研究结果表明，miR-219在AIS患者血清中高表达，提示 miR-219可能与AIS发病有关。本研究结果表明，轻度认知功能障碍组AIS患者血清中miR-219水平明显高于无认知功能障碍组，表明miR-219水平可能与AIS患者发生轻度认知功能障碍有关。

AIS患者认知功能障碍发生机制较复杂，但血清中一些标志物的变化可为早期诊断及治疗提供参考。一般认为，血液循环中的 miRNA 主要来源于体内凋亡或坏死的细胞，或者来源于细胞的主动释放及循环细胞的裂解等。miRNA可以通过血脑屏障，脑组织中miRNA水平与血清中miRNA水平变化是一致的。miR-219可能来源于受损的脑组织，有望通过检测血清中 miR-219水平预测AIS的发生与进展。缺血性脑卒中是脑卒中最常见的类型，不健康的生活方式，如吸烟、饮酒等因素，以及高血压、糖尿病等基础疾病因素可能均影响脑卒中的发生、发展。本研究分析发现，糖尿病、血清miR-219水平高是AIS患者发生轻度认知功能障碍的独立危险因素，提示有上述因素AIS患者发生轻度认知功能障碍风险较高。进一步研究发现，血清miR-219水平预测AIS患者发生轻度认知功能障碍的ROC曲线下面积为0.818，最佳截断值为1.34，提示血清miR-219水平对于AIS患者发生轻度认知功能障碍有一定预测价值。

综上所述，miR-219在AIS患者血清中高表达，且在有轻度认知功能障碍的AIS患者血清中表达更高，对AIS患者发生轻度认知功能障碍有一定预测价值。由于本研究临床资料少，miR-219在AIS患者认知功能障碍发生过程中的具体作用机制尚未明确，仍需进一步研究。