6种医院抑菌制剂的微生物限度检查方法适用性研究Δ

李 敏，龚 亚，曹 健，樊 莉

(陆军军医大学第二附属医院药剂科，重庆 400037)

医院制剂以临床需求为导向，生产灵活，能够弥补上市药品供给不足等缺点，是医院临床用药的重要组成部分[1]。国家卫生健康委员会等六部委发布的《关于印发加强医疗机构药事管理促进合理用药的意见的通知》[2]中指出，应“加强医疗机构药品配备管理……研究医疗联合体内临床急需的医疗机构制剂调剂和使用管理制度，合理促进在医疗联合体内共享使用”。医院制剂应保证产品质量稳定，建立质量控制体系。微生物限度检查是药品质量控制的重要环节，对检查方法进行适用性验证是保证药品检验结果可靠的基本要求[3]。复方替硝唑溶液[成制字(2016)B705017]、新面醑[总制字(2017)F705011]、复方呋喃西林滴鼻液[成制字(2016)B705016]、樟脑苯酚溶液[成制字(2016)B705036]、维生素E珍珠乳膏[总制字(2018)F705015]和复方碘溶液[成制字(2016)B705013]均为医院自制制剂，上述6种制剂均有不同程度的抑菌作用[4]。制剂中的抑菌成分会干扰微生物限度检查，故对含抑菌成分的制剂进行微生物限度检查时，应先消除其抑菌活性，以保证方法的适用性[5]。对于含不同抑菌成分及抑菌成分含量不同的抑菌制剂，应建立专属性强、重复性好的微生物限度检查方法。本研究拟采用平皿法、培养基稀释法、薄膜过滤法和中和法针对不同剂型、含不同抑菌成分的医院制剂进行微生物限度适用性试验，消除其抑菌活性，建立准确可靠的微生物限度检查方法，以用于相关制剂质量控制检验。

1 材料

1.1 仪器

BP-Ⅱ型架盘天平(上海医用激光仪器厂)；LRH-70型生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；M0ST-T24-B型台式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；CS101-2ABN型电热鼓风干燥箱(重庆康诚永生实验设备有限公司)；BSC-1000-Ⅱ-A2型生物安全柜(苏州华宇净化设备有限公司)。

1.2 药品

复方替硝唑溶液(成分：替硝唑、醋酸氯己定等；批号：191224)，新面醑(成分：甲硝唑、氯霉素、水杨酸等；批号：200323)，复方呋喃西林滴鼻液(成分：呋喃西林、盐酸麻黄碱等；批号：191028)，樟脑苯酚溶液(成分：樟脑、苯酚等；批号：190905)，维生素E珍珠乳膏(成分：维生素E、珍珠粉及羟苯乙酯等；批号：200107)，复方碘溶液(成分：碘、碘化钾等；批号：191217)，均为陆军军医大学第二附属医院自制。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和大肠埃希菌[CMCC(B)44102]由中国食品药品检定研究院菌种保藏中心提供，均为第1代冷冻保存菌株；黑曲霉[CMCC(F)98003]由北京三药科技开发公司提供，为第4代冷冻保存菌株。

1.4 培养基、试剂及稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：180427)、胰酪大豆胨液体培养基(批号：171218)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：170316)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号：161118)、麦康凯液体培养基(批号：170313)、麦康凯琼脂培养基(批号：171211)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：181227)和甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：180326)均购自北京陆桥技术股份有限公司，经过适用性试验验证，符合《中国人民共和国药典：四部》(2015年版)的规定；聚山梨酯-80(成都市科隆化学品有限公司，批号：2017091901)，硫代硫酸钠(上海强顺化工有限公司，批号：20080822)；稀释液为0.9 %氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司，批号：M19061505-1)。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

取复方替硝唑溶液(A)、新面醑(B)和复方呋喃西林滴鼻液(C)各10 ml，用稀释液逐级稀释制成1∶ 10、1∶ 100(V/V)的供试液；取樟脑苯酚溶液(D)10 ml,加入温热融化的聚山梨酯-80 10 ml，用稀释液逐级稀释制成1∶ 10、1∶ 100(V/V)的供试液；维生素E珍珠乳膏(E)10 g，加入温热融化的聚山梨酯-80 10 ml，用稀释液逐级稀释制成1∶ 10、1∶ 100(g/V)的供试液；取复方碘溶液(F)10 ml，加入0.5 mol/ml的硫代硫酸钠溶液10 ml，用稀释液稀释制成1∶ 10(V/V)的供试液。

2.2 菌液的制备

按照《中国人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1105和通则1106中规定的菌液制备方法，制成适宜浓度的各菌悬液。

2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验

分别取A、B、C和D供试液10 ml以薄膜过滤，用稀释液冲洗滤膜数次，每次100 ml，在最后1次冲洗液中分别加入≤100 cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液1 ml，混匀，过滤，取出滤膜菌面朝上贴于琼脂培养基平板上。分别取E、F供试液9.9 ml，分别加入≤10 000 cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液0.1 ml，混匀，取1 ml置无菌平皿中，注入15～20 ml温度≤45 ℃熔化的琼脂培养基，混匀，凝固。胰酪大豆胨琼脂培养基于32.5 ℃培养2 d，作为需氧菌计数检查；沙氏葡萄糖琼脂培养基于22.5 ℃培养3 d，作为霉菌和酵母菌计数检查，作为试验组。供试品对照组以稀释液代替菌液，菌液对照组以稀释液代替供试液，乳化剂对照组以聚山梨酯-80代替供试品，中和剂对照组以硫代硫酸钠溶液代替供试品，其余均同试验组操作。

计算回收率：试验组的回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数；乳化剂对照组的回收率=乳化剂对照组平均菌落数/菌液对照组平均菌落数；中和剂对照组的回收率=中和剂对照组平均菌落数/菌液对照组平均菌落数。需氧菌、霉菌和酵母菌各试验菌株的回收率见表1。供试品A、B、C和D采用薄膜过滤法经300 ml冲洗液冲洗进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数检查；供试品E以1∶ 100稀释级进行需氧菌计数检查，1∶ 10稀释级进行霉菌及酵母菌计数检查；供试品F选用0.5 mol/ml的硫代硫酸钠溶液作为中和剂进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数检查，方法可行。经验证，10%的聚山梨酯-80及0.5 mol/ml的硫代硫酸钠溶液不会干扰上述各菌株的生长。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌各试验菌株的回收率(n=2)Tab 1 Recovery rates of various test bacterial strains of aerobic bacteria, molds and yeasts (n=2)

2.4 控制菌检查方法的适用性试验

分别取1∶ 10的A、B、C和D供试液10 ml，以薄膜过滤，用稀释液冲洗滤膜数次，每次100 ml，在最后1次冲洗液中分别加入≤100 cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希菌的菌悬液1 ml，混匀、过滤，取出滤膜，加至适宜体积的胰酪大豆胨液体培养基中；取1∶ 10的E、F供试液10 ml，及≤100 cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希菌菌悬液1 ml，加至适宜体积的胰酪大豆胨液体培养基中。上述培养物照《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则1106中控制菌检查方法进行检查，作为试验组。供试品对照组以稀释液代替菌液，阴性对照组以稀释液代替供试液和菌液，阳性对照组以稀释液代替供试液，乳化剂对照组以聚山梨酯-80代替供试品，中和剂对照组以中和剂代替供试品，其余均同试验组操作。

6种制剂采用不同的方法，控制菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希菌可检出，见表2。其中，复方碘溶液在供试品制备过程中加入同体积的0.5 mol/ml硫代硫酸钠溶液进行试验，检查方法可行。经验证乳化剂及中和剂对3种菌种均无毒性。

表2 控制菌检查的适用性试验结果Tab 2 Results of applicability test of control bacteria detection

3 讨论

本研究建立了6种有抑菌作用的医院制剂的微生物限度检查方法。对于具有抑菌活性的供试品，若在最低稀释级无法进行方法适用性试验时，根据相应的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响结果判断的前提下，通过增加稀释级的方法进行试验。若供试品的抑菌活性较强，可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入菌液进行方法适用性试验，必要时可联合使用多种方法[6]。本研究选用适宜的试验方法，有效消除了含多种抑菌成分制剂的抑菌活性。

替硝唑和甲硝唑属硝基咪唑类药物，对厌氧菌具有较高的活性[7-9]；氯霉素和呋喃西林属广谱抗菌药物，对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌有显著的抑制作用[10-11]；醋酸氯己定为阳离子表面活性剂，对普通细菌及厌氧菌均有良好的杀菌作用，即使低浓度下也具有较强的抑菌效果[12-14]。上述药物易溶于水，且相应的复方替硝唑溶液、新面醑和复方呋喃西林滴鼻液3种制剂均属液体制剂，因此，优先采用薄膜过滤法，以消除其抑菌作用。樟脑对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等有抗菌作用[15-16]；苯酚对细菌和霉菌均有抑菌作用，尤其对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用[17]。本研究中，对樟脑苯酚溶液采用薄膜过滤法进行微生物计数检查，采用薄膜过滤法结合培养基稀释法进行控制菌检查。维生素E珍珠乳膏因添加防腐剂羟苯乙酯而具有抑菌作用，羟苯乙酯可使微生物蛋白质变性而起到抑制菌落生长的作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、酵母菌和霉菌都有一定的抑制作用[18-19]。本研究中，通过增加供试品稀释级进行微生物计数检查，增加接种培养基体积进行控制菌检查，可消除维生素E珍珠乳膏的抑菌活性。碘因强氧化性能有效灭活病原体，对细菌、真菌、病毒及芽孢等微生物均有较强的杀灭作用[20-21]。本研究中，对复方碘溶液采用中和法，通过硫代硫酸钠将碘还原成碘离子，从而消除其抑菌活性。

复方替硝唑溶液、新面醑、复方呋喃西林滴鼻液和樟脑苯酚溶液均采用1∶ 100稀释级进行薄膜过滤。前期试验及文献报道显示，该类制剂以1∶ 10稀释级进行试验时，薄膜过滤冲洗体积均>500 ml，且需多种方法联合使用方可消除其抑菌活性，试验耗损较大[22-24]。《中华人民共和国药典：四部》(2020年版)[25]通则中的微生物限度检查薄膜过滤法部分新增总冲洗量一般≤500 ml，本研究中的试验方法符合该规定。对于含多种抗菌成分的强抑菌制剂，在符合《中华人民共和国药典》规定下，通过增加供试液稀释级再进行薄膜过滤，能有效减少冲洗液的体积；油性、乳膏等水不溶性制剂，难以被普通的稀释液稀释，可加入适量的乳化剂助其溶解，形成均一、稳定的供试液，从而更加准确地检测出相应菌种；乳膏制剂易造成薄膜堵塞，选择培养基稀释法进行试验，从而更加简便、准确地进行微生物限度检查；含有易于被其他物质中和的成分的制剂，优先采用中和法进行试验，可克服薄膜过滤法和培养基稀释法操作繁琐且试验耗费大等缺点。

本研究建立了含替硝唑、甲硝唑、氯霉素和呋喃西林等抗菌药物及含醋酸氯己定、樟脑、苯酚、羟苯乙酯和碘等消毒防腐药的微生物限度检查方法，针对不同剂型、不同抑菌成分的制剂采用不同的试验方法，可精准消除抑菌成分对微生物限度检查的干扰，使操作简便、快捷，结果准确、可靠。本研究所建立的方法也同样适用于《中华人民共和国药典》(2020年版)标准，为医院制剂的质量控制提供了可靠的检测手段，也为类似制剂的微生物限度检查方法适用性试验提供了参考。