基于网络药理学和分子对接技术探讨鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的作用机制Δ

阮意丹，黄志鸿，陈美琳，吴嘉瑞

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

鼻炎是由细菌、病毒、过敏原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔炎症性疾病，其诱因不同，症状也有所不同，可分为急性鼻炎、慢性鼻炎、变应性鼻炎、药物性鼻炎和萎缩性鼻炎[1]。目前，西医治疗鼻炎的效果并不理想，激素、抗菌药物的使用虽能抗菌消炎、缓解症状，但治愈困难，预后不良。为增强疗效，减少抗菌药物及激素的使用，临床上可用鼻渊通窍颗粒联合西药配合治疗，如孟鲁斯特、糠酸莫米松鼻喷剂。鼻渊通窍颗粒源自《剂生方》所载的经典古方——苍耳子散，是在原方基础上加减研制而成，可疏风清热、宣肺通窍，改善炎症介质，减轻炎症反应，是近年来临床治疗鼻炎的重要辅助用药[2]。网络药理学是基于大数据时代背景下诞生的多学科交叉融合的科学，借助系统生物学、药理学、多种网络数据平台以及现代计算机技术，构建“疾病、基因、靶点、药物”之间的相互关系网络，揭示中药及其复方“多基因、多靶点、多途径”的作用机制[3-4]。本研究将借助网络药理学，结合分子对接技术，探讨鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的分子作用机制，以期为进一步的药理作用研究和临床合理应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 鼻渊通窍颗粒的活性成分筛选及靶点收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中药综合数据库(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)(https://119.3.41.228∶ 8 000/tcmid/search/)，检索辛夷、苍耳子(炒)、麻黄、白芷、薄荷、藁本、黄芩、连翘、野菊花、天花粉、生地黄、丹参、茯苓和甘草14味中药的化学成分，筛选口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[4]的活性化合物及其潜在作用的蛋白质靶点，并根据明确的生物活性报道对鼻渊通窍颗粒的活性成分及其靶点进行补充。筛选结束后，利用Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将所筛选出的靶点转换为相对应的基因名。将得到的鼻渊通窍颗粒活性成分及其靶点导入Cytoscape 3.7.2，构建“药物-化合物-靶点”网络。

1.2 鼻炎相关靶点的收集

以“rhinitis”为关键词，检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/search/)、GenCLiP数据库(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM数据库(https://omim.org/)，收集与鼻炎相关的靶点，合并5个疾病数据库靶点，删除重复值后得到鼻炎相关靶点。

1.3 鼻炎相关蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建

将得到的鼻炎相关靶点导入STRING 11.0数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)中，获取生物物种为“Homo sapiens”、最小互相作用阈值为“highest confidence(0.900)”的蛋白质互作关系数据，将其导入Cytoscape 3.7.2软件构建相应的PPI网络。

1.4 鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的“化合物-靶点”网络的构建与分析

利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能，将鼻渊通窍颗粒的“药物-化合物-靶点”网络与鼻炎相关靶点的PPI网络合并，选取网络交集部分作为鼻渊通窍颗粒活性成分治疗鼻炎的潜在作用靶点[5]。通过Cytoscape 3.7.2构建鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的“化合物-靶点”网络，并对其进行拓扑学分析，选取节点度值在平均数以上的化合物作为鼻渊通窍颗粒发挥作用的关键化合物。

1.5 鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的PPI网络构建与分析

将鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的潜在作用靶点导入STRING 11.0数据库，获取生物物种为“Homo sapiens”、最小互相作用阈值为“highest confidence(0.900)”的蛋白质互作关系数据，将其导入Cytoscape 3.7.2软件构建相应的PPI网络，并进行拓扑学分析，选取节点度值在平均数以上的靶点作为鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的核心靶点。

1.6 基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

利用R软件中的“org．Hs．eg．Db”“clusterProfiler”及“DOSE”[6]对鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并对其结果进行可视化。选取KEGG分析中前20条通路在Cytoscape 3.7.2软件中构建“关键化合物-核心靶点-通路”网络。

1.7 分子对接验证

选取“1.4”项下度值排序居前4位的关键化合物作为分子对接的配体，通过PubChem获取其SDF格式，利用Chem3D软件将SDF格式转化为PDB格式。选取“1.5”项下度值排序靠前且有文献报道的经典靶点作为分子对接的受体，通过PDB数据库获取其相应靶点蛋白的结构信息。利用AutoDockTools 1.5.6对配体和受体进行结构处理和文件转换，运行Vina进行分子对接，最后通过PyMOL软件对结果进行可视化处理[7]。

2 结果

2.1 鼻渊通窍颗粒的活性成分及其靶点

经初步筛选共获得297个化合物和476个靶点，其中辛夷19个，苍耳子(炒)11个，麻黄23个，白芷22个，薄荷11个，藁本3个，黄芩36个，连翘23个，野菊花12个，天花粉2个，生地黄5个，丹参65个，茯苓15个，甘草92个。利用Cytoscape 3.7.2构建“药物-化合物-靶点”网络，见图1。图中，菱形节点代表靶点，正六边形节点代表药物，正八边形节点代表化合物，节点大小与节点的度值呈正比关系。

图1 “药物-化合物-靶点”网络图Fig 1 Network diagram of “drug-compound- target”

2.2 鼻炎相关靶点PPI网络

在OMIM、GeneCards、DisGeNET、GenCLiP和TTD等5个疾病数据库中共检索到1 295个与鼻炎相关的靶点，借助STRING 11.0数据库获得PPI关系，在Cytoscape 3.7.2 软件中构建鼻炎相关的PPI网络，见图2，该网络共含有881个节点和6 898条边，节点大小与节点的度值呈正比关系。

图2 与鼻炎相关的PPI网络图Fig 2 PPI network associated with rhinitis

2.3 鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的“化合物-靶点”网络

利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能，将鼻渊通窍颗粒“药物-化合物-靶点”网络与鼻炎相关靶点的PPI网络合并取交集，存在交集的靶点即鼻渊通窍颗粒活性成分治疗鼻炎的潜在作用靶点，共有113个。在Cytoscape 3.7.2中构建鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的“化合物-靶点”网络，见图3，图中左边圆形节点代表潜在靶点，右边圆形节点代表化合物，节点大小与节点的度值呈正比关系。通过Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network对该网络进行拓扑学分析，根据度值大小筛选鼻渊通窍颗粒发挥作用的关键化合物，节点度值的均值为7.560 846 561，节点度值≥8的化合物共有44个，见表1。

图3 鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的“化合物-靶点”网络Fig 3 “Compound-target” network of Biyuan Tongqiao granule in the treatment of rhinitis

表1 关键化合物的基本信息Tab 1 Basic information of key compounds

2.4 鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的PPI网络

借助String 11.0数据库和Cytoscape 3.7.2构建鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的PPI网络，并对其进行拓扑学分析，筛选得到度值在均值以上的靶点共42个，即为鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的核心靶点，见表2。

表2 核心靶点的基本信息Tab 2 Basic information of core target

2.5 GO和KEGG富集分析

利用R软件对鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的潜在作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。其中，GO功能富集结果显示：生物过程方面，主要富集条目为对细菌来源的分子应答(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖应答(response to lipopolysaccharide)和氧化应激反应(response to oxidative stress)等；细胞组成方面，主要富集条目为膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)和膜区(membrane region)等；分子功能方面，主要富集条目为细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、细胞因子活性(cytokine activity)和受体配体活性(receptor ligand activity)等。根据P值排序，分别对前10个条目进行可视化分析，得到柱状图，见图4，图中纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集个数。KEGG通路富集结果显示，靶点主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17、美洲锥虫病(Chagas disease)、乙型肝炎(Hepatitis B)、TNF、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)及甲型流感(Influenza A)等通路上。AGE-RAGE信号通路在鼻炎发病机制中起到重要作用，图5显示的是鼻渊通窍颗粒通过作用于PRKCA、PRKCB、AKT1及JUN等4个靶点来抑制炎症反应，从而发挥治疗鼻炎的作用。对P值排序居前30位的信号通路进行高级气泡图分析，见图6，图中气泡颜色由浅灰到深灰表示P值从大到小，P值越小代表显著性越强，气泡越大代表该通路的基因计数越大，横轴代表该通路基因所占总体输入基因的比率。在Cytoscape 3.7.2软件中构建“关键化合物-核心靶点-通路”网络，见图7，图中圆形节点代表通路，正八边形节点代表靶点，菱形节点代表化合物，节点大小与节点度值呈正比。

图4 GO功能富集分析(纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集个数)Fig 4 GO enrichment analysis (vertical coordinate indicates enrichment items, horizontal coordinate indicates enrichment number)

图5 AGE-RAGE信号通路图Fig 5 AGE-RAGE signal pathway diagram

图6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

图7 鼻渊通窍颗粒的“关键化合物-核心靶点-通路”网络Fig 7 “Key compound-core target-pathway” network of Biyuan Tongqiao granules

2.6 分子对接

利用AutoDock Vina软件[8]对度值排序靠前的关键化合物(Quercetin、Luteolin、Kaempferol和Wogonin)与核心靶点(TNF、JUN、MAPK1和IL-6)进行分子对接，结果显示，化合物与靶点蛋白的结合能均<-7 kcal/mol，见表3。结合能表示化合物与靶点蛋白的结合能力，结合能<-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性，结合能<-7.0 kcal/mol表示具有强结合活性，结合能的数值越小，表示受体与配体结合得越好，亲和力越高[9]。图8展示了部分化合物与靶点蛋白的分子对接模式，其中包括TNF与Quercetin(a)、JUN与Quercetin(b)、MAPK1与Luteolin(c)以及IL-6与Luteolin(d)。

表3 分子对接结果Tab 3 Results of molecular docking

3 讨论

鼻渊通窍颗粒具有疏风清热、宣肺通窍的功效，是耳鼻喉科常用的中药制剂，在临床上可用于治疗鼻炎和鼻窦炎。鼻炎的炎症反应表现为局部血管扩张和毛细血管通透性增加，药效学研究结果显示，鼻渊通窍颗粒对毛细血管通透性增加、肉芽组织增生有较好的抑制作用，可减少炎症渗出和水肿，达到通利鼻窍的效果[10]。为了进一步研究鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的分子作用机制，本研究借助网络药理学和分子对接方法，研究鼻渊通窍颗粒的活性成分，挖掘鼻炎相关靶点信息，构建“药物-化合物-靶点”网络、鼻炎相关PPI网络、鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的“化合物-靶点”网络、鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的PPI网络和“关键化合物-核心靶点-通路”网络，分析“药物、疾病、基因、靶点”之间的相互关系，系统阐释鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的分子作用机制。

A.TNF与quercetin；B.JUN与quercetin；C.MAPK1与luteolin；D.IL-6与luteolinA. TNF and quercetin; B. JUN and quercetin; C. MAPK1 and luteolin; D. IL-6 and luteolin图8 分子对接模式图Fig 8 Molecular docking pattern

对“化合物-靶点”网络、鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的PPI网络进行拓扑学分析，可得鼻渊通窍颗粒发挥作用的关键化合物有44个，治疗鼻炎的核心靶点共42个。其中，槲皮素在抗炎和免疫调节方面有较强的生物活性，可抑制白三烯、组胺和前列腺素等炎症介质的释放，减少促炎细胞因子的产生[11-12]。木犀草素可通过减少活性氧和活性氮的生成，抑制促炎细胞因子和炎症介质的表达，调节多种炎症信号通路等多途径缓解炎症反应[13]。山柰酚通过调节促炎酶的活性，抑制炎症因子的产生与表达，从而达到抗炎的效果[14]。STAT3、JUN和MAPK1涉及细胞的凋亡和增殖，IL-6、TNF与炎症反应、免疫反应相关。STAT3是介导炎症反应的关键因子[15]；JUN参与免疫细胞的增殖分化，下调JUN可抑制炎症反应[16]；MAPK1可抑制促炎细胞因子的产生，参与过敏性鼻炎的激活过程[17]；PTGS2基因在炎症反应过程中受炎症介质刺激时，其表达迅速上调[18]。分子对接结果也验证了上述关键化合物与核心靶点具有较强的结合活性，由此可推测鼻渊通窍颗粒可能主要通过上述化合物作用于核心靶点，达到对鼻炎的治疗作用。

GO功能富集结果显示，鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎的基因功能主要集中在对细菌来源的分子应答、对脂多糖应答、氧化应激反应、膜筏、膜微区、膜区、细胞因子受体结合、细胞因子活性和受体配体活性等。KEGG通路富集结果显示，靶点主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17、美洲锥虫病、乙型肝炎、TNF、Toll样受体信号通路和甲型流感等通路上。AGE-RAGE信号转导通路中，晚期糖基化终末产物(AGEs)通过与受体RAGE结合引起NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPK等多种细胞内信号通路的活化，从而激活转录因子核因子кB(NF-кB)的活性，促进炎症细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的表达[19]。说明鼻渊通窍颗粒可能是通过抑制AGEs/RAGE/NF-кB通路的激活来减少炎症反应，达到治疗鼻炎的效果。IL-17信号通路在许多免疫性疾病及炎症反应中发挥着重要作用，其通过JNK、NF-кB等传导信号，促进炎症细胞产生炎症因子，与鼻炎的发生有着密切关系[20]。TNF可诱导炎症反应和免疫调节等多种信号通路，与各种T细胞亚群相互作用，维持机体免疫平衡[21]；Toll受体在抗原刺激下激活多种下游信号通路，促使炎症介质释放，通过产生IL-1、IL-6和TNF等调节机体Th1/Th2平衡[22]。因此，鼻渊通窍颗粒可通过TNF信号通路和Toll样受体信号通路调节机体的免疫功能，抑制炎症介质释放，从而缓解变应性鼻炎的炎症反应。

综上所述，鼻渊通窍颗粒治疗鼻炎发挥作用的关键成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚和汉黄芩素，涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF和Toll样受体等多条通路，研究结果初步验证了鼻渊通窍颗粒发挥作用的多成分、多靶点、多途径的作用机制，为进一步探讨其药理作用机制和临床应用奠定了基础。