错配修复蛋白缺失相关子宫内膜癌的病理特征及其临床意义

邓茜 雷琼 李璐 高尤亮 俞文英 严俊龙 郭亚男 郑时玉 李海莉 蒙伶俐 卢立霞 李征 夏朝霞

Lynch综合征即遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary non-polyposis colorec-tal cancer，HNPCC）属于常染色体显性遗传病。人体碱基错配修复（mismatch repair，MMR）基因胚系突变后可导致遗传不稳定性，引起广泛的肿瘤易感性。其中女性Lynch综合征患者最常发生的是卵巢癌和子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）[1]，一部分女性Lynch综合征患者以EC为首发肿瘤，因此在EC患者中筛查Lynch综合征是可行且必要的。Lynch综合征确诊需依靠费用昂贵的二代测序（next generation sequencing，NGS）检测MMR基因胚系突变，无法进行大规模普筛工作，而日常工作中使用的免疫组化检测MMR蛋白的方法经济快捷，是初步筛查Lynch综合征的有效手段[2]。目前国内有关MMR蛋白缺陷相关子宫内膜癌（MMR protein deletion-related endometrial carcinoma，dMMR-EC）的研究较少，因此本研究旨在探讨dMMR-EC患者的临床病理特征及其临床意义，以便指导临床工作中初步筛查Lynch综合征患者，进而指导下一步的治疗方法和疾病管理。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年6月至2017年6月宁波市临床病理诊断中心诊断的EC患者294例，年龄28～86（56.4±9.4）岁。纳入的EC组织学类型有：子宫内膜样癌、浆液性癌、透明细胞癌、混合性腺癌、子宫癌肉瘤、未分化癌和去分化癌。组织学类型不包括中肾腺癌、中肾样腺癌、鳞状细胞癌、胃肠型黏液腺癌、转移性癌以及宫颈腺癌累及宫体等。本研究经本中心医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 病理检查 复阅所有患者经HE染色后的组织切片，观察肿瘤组织形态学特征、组织学类型、肌层浸润情况、淋巴结转移情况、组织学分级分期[按国际妇产科协会（Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO）标准执行]等临床病理学特征。

1.3 免疫组化检测及其抗体信息 所有标本均经10%中性甲醛溶液固定、脱水、包埋、4 μm切片。免疫组化采用Ventana Benchmark XT自动免疫组化仪（美国Ventana公司）染色。一抗：鼠抗人单克隆抗体MLHl（克隆号：ES05）和兔抗人单克隆抗体MSH2（克隆号：RED2）均购自福州迈新生物技术开发有限公司，兔抗人单克隆抗体MSH6（克隆号：EP49）购自北京中杉金桥生物技术开发有限公司，兔抗人单克隆抗体PMS2（克隆号：EP51）购自河南赛诺特生物技术开发有限公司。以每张切片中淋巴细胞、纤维间质细胞或癌旁子宫内膜腺体的胞核阳性为阳性内对照，阴性内对照使用PBS代替一抗。

1.4 二代测序及其主要试剂盒、仪器 每例需进行二代测序的患者均挑取一个含癌组织的蜡块，切成蜡卷，采用QIAamp DNA FFPE Tissue提取试剂盒（德国QIAGEN公司）提取组织内DNA后使用二代测序仪（型号：Hiseq 4000，美国Illumina公司）进行MMR基因的二代测序检测，DNA capture probes购自南京世和基因生物技术有限公司。

1.5 结果判读 MMR蛋白（包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6）在任何肿瘤细胞核明确着色即判定为阳性（如图 1、2、4、5，插页）[3]；所有肿瘤细胞核均不着色时即为阴性（如图3、6，插页）。间质淋巴细胞、纤维组织细胞及癌旁子宫内膜腺体均可作为阳性内对照，有助于分辨假阳性或假阴性。

图1 子宫内膜样癌病理切片所见（HE染色，×100）

图2 子宫内膜样癌中MLH1阳性表达（周围纤维间质细胞或淋巴细胞阳性表达，阳性内对照；免疫组化染色，×100）

图3 子宫内膜样癌中MSH6阴性表达（周围纤维间质细胞或淋巴细胞阳性表达，阳性内对照；免疫组化染色，×100）

图4 子宫内膜透明细胞癌病理切片所见（HE染色，×100）

图5 透明细胞癌中MSH2阳性表达（周围癌旁子宫内膜腺体阳性表达，阳性内对照；免疫组化染色，×100）

图6 透明细胞癌中PMS2阴性表达（周围癌旁子宫内膜腺体阳性表达，阳性内对照；免疫组化染色，×100）

1.6 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料 294例EC石蜡包埋标本中，诊断学刮宫（以下简称诊刮）标本22例，其余272例中有57例未清扫盆腔淋巴结，另外215例为EC根治标本。患者年龄＜50岁者72例，≥50岁者222例。组织学类型如下：子宫内膜样癌242例，平均年龄54.7岁；Ⅱ型EC有43例，其中透明细胞癌12例（平均年龄70.7岁），浆液性癌23例（平均年龄64.7岁），癌肉瘤8例（平均年龄59.6岁）；Ⅰ型和Ⅱ型混合性腺癌2例（平均年龄56.5岁）；去分化癌5例（平均年龄57.4岁）；未分化癌2例（平均年龄55.5岁）。242例子宫内膜样癌中不同FIGO分级占比分别为：Ⅰ级144例（59.5%），平均年龄52.5岁；Ⅱ级76例（31.4%），平均年龄57.1岁；Ⅲ级22例（9.1%），平均年龄61.0岁。FIGO分期：175例Ⅰ型子宫内膜样癌根治标本中Ⅰ期137例（78.3%），Ⅱ期25例（14.3%），Ⅲ期13例（7.4%），Ⅳ期0例（0.0%）。23例浆液性癌中18例为根治标本，FIGO分期分别为Ⅰ期10例，Ⅱ期2例，Ⅲ期6例，Ⅳ期0例。12例透明细胞癌中10例为根治标本，FIGO分期为Ⅰ期5例，Ⅱ期3例，Ⅲ期2例，Ⅳ期0例。8例癌肉瘤中6例为根治标本，FIGO分期Ⅰ期4例，Ⅱ期0例，Ⅲ期2例，Ⅳ期0例。5例去分化EC中，4例非诊刮标本FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期者分别各占1例。2例未分化癌均为根治标本，FIGO分期分别为Ⅰ期和Ⅱ期。混合型癌2例其中1例为根治标本，FIGO分期为Ⅰ期。

2.2 MMR蛋白表达情况 294例EC患者中，62例出现MMR蛋白的阴性表达，即为dMMR-EC患者，其余232例MMR蛋白阳性表达。多种组织学类型的EC均可出现MMR蛋白阴性表达（MMR阴性例数/总例数）：子宫内膜样癌（53/242）、透明细胞癌（1/12）、浆液性癌（2/23）、混合性腺癌（1/2）、癌肉瘤（2/8）、未分化癌（1/2）及去分化癌（2/5）。62例MMR蛋白阴性表达的EC患者可以出现特定组合内的单个MMR蛋白阴性表达，也可以出现特定组合内的2个MMR蛋白共同阴性表达，但未出现两个特定组合内的蛋白均阴性表达或交叉阴性表达的现象。本组研究62例dMMR-EC（阴性率21.1%）中，MLH1和（或）PMS2阴性表达40例（阴性率13.6%），MSH2和（或）MSH6阴性表达22例（阴性率7.5%）。

2.3 MMR基因二代测序结果 由于经费限制，本研究从62例dMMR-EC患者中按分层随机的方法挑选出21例进行二代测序检测MMR基因表达频谱，进行免疫组化结果的验证，结果21例dMMR-EC患者中有18例肿瘤组织内检测出MMR基因突变，其中10例MSH2和（或）MSH6蛋白阴性组织均出现MMR基因突变，11例MLH1和（或）PMS2蛋白阴性组织中有6例出现MMR基因突变，如图7（插页）。

图7 21例dMMR-EC二代测序MMR基因表达频谱（dMMR-EC为错配修复蛋白缺失相关子宫内膜癌；MMR为错配修复）

2.4 MMR蛋白阴性率与患者临床病理特征的关系MMR蛋白阴性率与年龄、组织学类型、非诊刮标本肌层浸润深度、根治标本淋巴结转移情况、FIGO分级和分期均无相关性（均P＞0.05）。而非Ⅱ型高级别EC患者MMR蛋白阴性率明显高于Ⅱ型高级别EC患者MMR蛋白阴性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 MMR蛋白阴性率与EC患者临床病理特征的关系[例（%）]

2.5 随访结果 62例dMMR-EC患者均进行电话随访，随访时间25～62个月，有效随访52例，其中无病生存49例，远处转移2例（随访时间分别为40和34个月），病死1例（随访时间为60个月）；失访10例。

3 讨论

人类MMR基因可以识别和修复DNA复制和重组过程中发生的错误性碱基插入、缺失和一部分DNA损伤，保证DNA高保真复制，维持染色体的稳定性[4]。MMR基因缺陷细胞的碱基突变率是正常碱基10到1 000倍[5]。目前研究较多的MMR基因类型主要是MLH1、PMS2、MSH2 和 MSH6[6]。

MMR基因缺陷有两种情况，一种是可遗传的种系或胚系突变，常常导致Lynch综合征；另一种就是不可遗传的体细胞或肿瘤细胞突变。筛查dMMR-EC对识别高复发风险[7-8]或遗传性EC患者（如Lynch综合征）有帮助[8-9]。

Lynch综合征是MMR基因发生种系或胚系突变所致的一种常染色体显性遗传性疾病，表现为多系统多器官肿瘤易感性（多种组织癌变概率大大增加，如胃、女性生殖道、胆道、尿道、小肠、大脑和胰腺等）。女性Lynch征患者最常发生的肿瘤是卵巢癌和EC[1]，一部分Lynch综合征患者以EC为首发肿瘤。因此，在EC患者中开展Lynch综合征筛查是可行而必要的，便于及时发现和预防患者Lynch综合征相关的其他肿瘤的发生。此外，Lynch综合征亲属也可以尽早进行遗传咨询及基因检测，预防发生Lynch综合征相关肿瘤。

免疫组化检测MMR蛋白的表达是筛查Lynch综合征相关肿瘤的有效方法，已经普遍应用于筛查Lynch综合征相关结直肠癌患者的工作流程[2]，近年来Lynch综合征相关EC（Lynch syndrome-related endometrial cancer，Lynch-EC）备受关注，Scnter等和 Frolova 等[10-11]的研究显示与MMR基因检测结果比较，免疫组化法检测MMR蛋白的灵敏度、特异度分别为0.91、0.88，因此推荐将免疫组化检测MMR蛋白作为Lynch-EC的初筛手段。近年来，就Lynch-EC的具体筛查方案、临床病理学特征、治疗及预后等是研究热点[12-15]。因此，本研究通过免疫组化检测MMR蛋白的表达初步筛查Lynch-EC展开相关研究。

本组研究中294例EC患者的MMR蛋白阴性率为21.1%（62/294），其中 MLH1和（或）PMS2蛋白阴性率13.6%（40/294），MSH2和（或）MSH6蛋白阴性率 7.5%（22/294），MMR蛋白阴性率在大多数国内外研究报道的范围内，但略低于某些国外报道的45%[16]，有可能是筛查种群及地域不一样所致。此外，本研究结果表明多种组织学类型的EC，包括子宫内膜样癌、透明细胞癌、浆液性癌、混合性腺癌、癌肉瘤、未分化癌及去分化癌等均可出现MMR蛋白阴性表达。除此以外，不论患者年龄是否＜50岁、肿瘤浸润肌层是否＞1/2、是否具有淋巴结转移以及FIGO分级分期程度，MMR蛋白阴性率均无统计学差异。此结果支持推荐所有初次确诊的EC均进行MMR蛋白检测以达到Lynch-EC初筛的目的。这一结论与国内外主流观点基本一致[17]，但Ruiz等[18]的研究表明MMR蛋白阴性病例更常见于浸润深度＜1/2肌层的病例，而Long等[19]的研究报道MMR蛋白阴性病例具有更深的肌层浸润，可能是研究对象地域不同所致，也可能数据量有限，这需要大数量级数据进一步研究。此外，Pina等[20]研究报道显示，组织学类型为去分化EC更容易出现出现MMR蛋白阴性，而本研究入组的去分化EC患者例数较少，难以进行统计学分析，因此，有待收集更多的病例进一步研究。

国内外多项研究均进行了低级别EC和高级别EC中MMR阴性率的比较，结果它们的阴性率比较差异均无统计学意义，本研究结果跟上述结果一致，但本研究进一步把高级别EC分成Ⅱ型癌和非Ⅱ型癌两组，统计学分析后发现非Ⅱ型高级别EC患者MMR蛋白阴性率（35.5%，11/31）高于Ⅱ型高级别EC患者的（11.6%，5/43），也就是说，组织学类型为非Ⅱ型高级别的EC时应作为Lynch-EC的重点筛查对象，应特别注意是否有MMR蛋白阴性，并进一步明确是否为Lynch-EC。

2013年，美国癌症基因组图谱提出将EC区分为DNA聚合酶ε（POLE）突变型、微卫星不稳定（microsatellite Instability，MSI）高突变型、高拷贝数型和低拷贝数型4种分子亚型[21]。2015年Talhouk等[22]使用免疫组化替代基因分型的方案，证明基于免疫组化检测MMR蛋白筛选MSI高突变型EC是可行的。2020年，EC的分子分型以及基于免疫组化的分子分型方案被正式写入第5版《WHO女性生殖肿瘤分类》中并且指出这4种分子分型中POLE突变型和MSI高突变型预后最好，其次为低拷贝数型，而高拷贝数型预后最差。本研究筛选的62例dMMR-EC基本可等同于MSI高突变型EC，预后相对较好，随访资料与此相符。对部分dMMR-EC（21例）进行的基因水平的验证，结果21例dMMR-EC中16例出现对应MMR基因突变（16/21，76.2%），其中10例MSH2和/或MSH6蛋白阴性的病例NGS结果均出现对应的基因突变（10/10，100.0%），11例 MLH1和/或 PMS2蛋白阴性的病例6例NGS结果出现对应的基因突变（6/11，54.5%），说明MSH2和/或MSH6的免疫组化与NGS基因检测结果的一致性优于MLH1和（或）PMS2的。

众多研究表明MMR缺失的多种肿瘤（包括dMMREC）受益于程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）单抗的治疗。2015 年，Le 等[23]的研 究 显示PD-1单抗pembrolizumab对MMR缺陷型肿瘤的治疗作用明显高于MMR正常表达的肿瘤。2017年，Le等[24]研究发现12种MMR缺陷型肿瘤的86例晚期患者使用pembrolizumab治疗后，57%的患者出现影像学层面的病情缓解，21%的患者获得完全缓解。2017年6月，美国临床肿瘤协会推荐PD-1单抗治疗EC尤其是dMMR-EC患者[25]。因此，临床工作中筛查出dMMR-EC患者对其进一步的治疗具有一定的指导意义，这一点在一些需要术后辅助治疗的高级别EC中显得尤其重要。这也是本研究的意义之一：把高级别EC里的dMMR-EC用免疫组化筛选出，可以个体化制定有效的治疗方案。

综上所述，本研究通过免疫组化检测EC中MMR蛋白的表达，分析EC组织中MMR蛋白阴性率与其临床病理特征的相关性，指出推荐所有初次确诊的EC患者进行免疫组化检测MMR蛋白的表达，进行Lynch-EC初筛，其中非Ⅱ型高级别EC是重点筛查对象。本研究进一步讨论了在实际临床工作中使用免疫组化检测EC组织中 MMR蛋白的表达意义：（1）有助于开展Lynch-EC的初筛工作，对预防Lynch-EC患者本人再次发生或家族其他成员发生Lynch综合征相关的肿瘤有一定意义；（2）有助于将预后不同的高级别EC进行分组，并指导相应的药物治疗（如可受益于PD-1单抗治疗），利于高级别EC的疾病管理。