血清β-羟丁酸水平对猫脂肪肝的诊断及预后价值分析

朱道仙，陆 江，郝福星，吴 植，刘 莉

(1.江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院宠物科技学院，江苏泰州 225300；3.江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300)

猫脂肪肝(Feline hepatic lipidosis，FHL)是猫最常见的肝胆疾病，如不进行积极有效地治疗,病死率可达90%以上，严重危害猫的健康与生命[1]。目前，该病的诊断主要依赖临床症状特征、血液生化、影像学检查及病理学检测等[2-3]。这些方法还存在一定的局限性，如临床症状及血液生化易于其他肝病混淆，B超检查很难区分FHL与肥胖症，病理学检测具有创伤性易引发肝出血等缺点，容易造成漏诊和误诊，降低了治疗效果。虽然有些新的诊断方法报道[4-5]，但由于操作复杂或价格昂贵，未在临床普及。因此，临床上缺乏可靠的检测手段来协助猫脂肪肝的诊断与预后。

β-羟丁酸(BHBA)是脂肪酸氧化产生的一种中间代谢产物，正常情况下能很快被分解利用，血液中含量很低，当BHBA产生过量时可积聚于血液中，形成酮血症[6]。有研究表明，BHBA与猫脂肪肝的发生发展密切相关[7]。本研究回顾性收集了大量猫脂肪肝的病例，旨在分析血清BHBA在猫脂肪肝中的表达情况及其相关性，为该病的诊断和预后提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 β-羟丁酸检测试剂盒，宁波瑞源生物科技有限公司产品；血糖、总蛋白、三酰甘油、总胆固醇、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶及碱性磷酸酶等指标检测试剂，爱德士生物科技公司产品。

1.1.2 仪器设备 CatalystDx动物生化分析仪，美国爱德士生物科技公司产品；DU8-M6全数字彩色B超仪，徐州市瑞华电子科技发展有限公司产品；Multiskan GO酶标仪，赛默飞世尔科技公司产品。

1.1.3 临床样本 样本采自2017年1月至2019年12月在江苏农牧科技职业学院教学宠物医院就诊的患猫，根据症状学特征(黄疸、呕吐及厌食)、血液生化指标(肝功能异常)和肝脏B超检查(肝内回声增强)初诊为猫脂肪肝的病例。然后，以超声引导下细针抽吸肝细胞进行细胞学评估，以单位面积≥1/3肝细胞发生脂肪变性为金标准[8]，共收集37例脂肪肝患猫作为脂肪肝组。

同时，按年龄、性别及体重相近原则，选取同期就诊有黄疸症状、肝功能指标异常，但肝脏B超检查未发现脂肪肝征象的患猫37例作为其他肝病组和健康体检猫(未有任何临床症状，血液生化指标正常)37例作为健康对照组。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 所有样本在就诊当天采集静脉血5 mL，1 500 r/min离心10 min，分离出血清。采用全自动血液生化分析仪检测血清中血糖(Glu)、总蛋白(TP)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(Chol)及总胆红素(TBIL)水平，同时检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及碱性磷酸酶(ALP)活性。血清β-羟丁酸(BHBA)用酶比色法测定，操作步骤严格按照说明书进行。

1.2.2 治疗效果评价 收集所有脂肪肝患猫的治疗资料，包括治愈情况、死亡情况、疗程等。治愈判定标准为临床症状消退，血液肝功能指标正常，并计算治愈率=治愈数/总病例数×100%。

1.2.3 样本量估算 本研究以受试者工作曲线(ROC曲线)下面积(AUC)为主要指标估算样本量。假设血清BHBA能有效区分脂肪肝患猫与非脂肪肝患猫，AUC>0.5。前期预试验获知BHBA的AUC为0.7，显著性水平α=0.05，β=0.1，假阳性率(false positive rate，FPR)取值范围为0～1.0，组间比例1∶1，采用PASS 16.0软件估算样本量。结果表明，至少需要纳入脂肪肝患猫33例，对照33例。而本研究纳入患猫与两组对照猫均为37例，满足研究要求。

1.2.4 数据处理分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。正态分布的连续型数据用平均值±标准差表示，非正态分布连续型数据用中位数(最小值，最大值)表示。采用ANOVA单因素方差分析事后多重比较LSD进行组间两两比较，非正态分布数据采用非参数检验比较组间差异，百分率比较采用卡方检验，BHBA与其他指标相关性采用Pearson相关性分析。根据绘制受试者工作曲线(ROC)来判断血清BHBA的诊断效能。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 血液生化指标的变化

从表1可以看出，与健康对照组比较，脂肪肝组及其他肝病组的血清TP显著降低，且低于参考范围，血清TBIL、ALT、AST及ALP显著升高(P<0.05)，且高于参考范围。与其他肝病组比较，脂肪肝组血清TBIL及ALP升高显著(P<0.05)。脂肪肝组血清Chol水平虽然显著高于其他肝病组和健康对照组(P<0.05)，但还在参考范围内。

表1 各组血液生化指标的比较

2.2 血清BHBA水平的变化

脂肪肝患猫血清BHBA水平为1.30 mmol/L±0.65 mmol/L，其他肝病患猫血清BHBA水平为0.47 mmol/L±0.22 mmol/L，健康猫血清BHBA水平为0.38 mmol/L±0.13 mmol/L，脂肪肝组患猫血清BHBA水平极显著高于其他肝病组和健康对照组(P<0.01)，如图1A所示。以参考值上限[10](0.5 mmol/L)为阈值，高于阈值定义为BHBA升高，结果发现脂肪肝组的37例病例中有32例表现为BHBA升高，占比86.48%，极显著高于其他肝病组(32.43%)和健康对照组(16.22%)P<0.01)，如图1B所示。

2.3 脂肪肝组血清BHBA与肝功能生化指标的相关性

将脂肪肝组患猫血清BHBA与ALT、AST、ALP及TBIL等指标进行Pearson相关性分析。结果发现，BHBA与ALP呈现强的正相关关系(r=0.776,P<0.01，图2C)，与ALT、TBIL呈中等正相关关系(r值分别为0.534、0.503，P<0.01，图2A、图2D)，与AST无相关性(r=0.141,P>0.05，图2B)。

图2 脂肪肝组血清BHBA与ALT、AST、ALP及TBIL等指标的相关性

2.4 血清BHBA在猫脂肪肝中的诊断效能

ROC曲线下面积(AUC)是反映诊断效能的一个重要指标，AUC越大，诊断可靠性就越强。由图3可知，BHBA的敏感度为94.6%，特异性为75.7%，截断值为0.828 mmol/L，AUC为0.923，P<0.01，说明血清BHBA对猫脂肪肝具有较好的诊断价值。

图3 血清BHBA对猫脂肪肝的ROC曲线图

F.脂肪肝组；L.其他肝病组；H.健康对照组

2.5 血清BHBA对猫脂肪肝治疗结果的影响

以BHBA截断值0.828 mmol/L为分割点，将37例脂肪肝患猫分成2组，BHBA<0.828 mmol/L组共12例，全部治愈，治愈率为100%，显著高于BHBA≥0.828 mmol/L组的72.0%(P<0.05)，疗程中位数为7.0 d，显著低于BHBA≥0.828 mmol/L组的9.5 d(P<0.05)，结果见表2。

表2 不同血清BHBA水平脂肪肝患猫治疗效果的比较

3 讨论

目前，FHL主要根据病史、临床表现、血液生化、临床病理结果和肝脏超声表现进行诊断。然而，病史、临床表现和血液生化检查对FHL诊断的特异性较差，其他潜在的疾病过程都可能造成混淆。本研究发现，FHL患猫的病史及临床表现与其他肝脏疾病相似，血液中ALT、AST及TBIL等肝功指标虽然高于健康猫，但与患有其他肝病猫无差异，也说明目前这些诊断依据的特异性较差，容易误诊。肝脏超声检查可以提高FHL诊断，有研究表明由3名委员会认证的放射科医生进行腹部超声检查，对FHL诊断的准确率为70%[11-12]，也满足不了临床的需求，会出现漏诊。最终诊断通常是通过细针抽吸肝细胞进行细胞学评估或通过肝活检进行组织学评估来做出，存在创伤性，容易出现感染及出血等并发症[13]。由此可见，寻找一种对FHL诊断具有灵敏度高、特异性强的诊断标志物十分重要。

负能量平衡被认为是FHL发生的主要原因[14]。在负能量平衡状态下，脂肪组织中大量的甘油三酯被动员分解，产生的游离脂肪酸进入肝脏，在线粒体中进行β-氧化生成乙酰辅酶A，然后乙酰辅酶A可进入三羧酸循环或合成酮体释放入血液。酮体是脂肪酸在肝内正常分解代谢的中间产物，包括β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中含量最多的是β-羟丁酸[15]。本研究发现，有86.48%的FHL患猫血液中β-羟丁酸水平高于生理阈值，且脂肪肝组β-羟丁酸水平高于其他肝病患猫和健康猫，这与相关报道在患有FHL的猫中，酮体形成增加的结论相一致[16]。

ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高，因此ROC曲线成为多种疾病诊断性试验的主要分析方法[17-18]。本研究结果表明，β-羟丁酸对FHL的诊断具有较高的效能(AUC=0.923)，具有良好的敏感性和特异性，说明β-羟丁酸在FHL诊断中具有一定的临床应用价值。

在本研究中，相对于血β-羟丁酸≥0.828 mmol/L的患猫，血β-羟丁酸<0.828 mmol/L患猫的治愈率明显提高，疗程显著缩短。因此，血β-羟丁酸水平可指导FHL的临床治疗，对于β-羟丁酸≥0.828 mmol/L的患猫应高度关注，探讨能否通过改变治疗方案来提高治疗效果。

综上所述，血清β-羟丁酸水平对猫脂肪肝诊断具有一定意义，其水平变化与脂肪肝关系密切。动态监测血清β-羟丁酸水平可作为猫脂肪肝诊断及预后评价的参考指标。