安徽省部分散养鸡场球虫感染情况的调查

姚婧婷，尤向峰，李明珠，葛 宁，冯学松，刘欣超，顾有方，李文超*

(1.安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100；2.广德市农业农村局，安徽宣城 242200)

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道引起的一种严重的原虫病，临床上常见多发，可给养鸡造成巨大的经济损失[1]。传统上，不同鸡球虫虫种的鉴定主要依赖于球虫卵囊和孢子囊形态、寄生部位及病变特征等，费时费力，且不能精确区分不同虫种[2]。PCR技术因其具有简便、快速、灵敏度高的优点，已逐渐应用到球虫分类领域。目前，已发展了不少鉴别不同种鸡球虫的PCR方法，常用的靶基因有18S rDNA、5S rDNA、内转录间隔区(internal transcribed spacer 1，ITS，包括ITS-1和 ITS-2)以及特征序列扩增区(sequence characterized amplified regions,SCAR)基因等，其中基于ITS基因的PCR已广泛应用于鸡球虫病的诊断及流行病学调查中[2-4]。

国内有关鸡球虫病流行病学方面的研究较多，但相关研究基本上是采用饱和盐水漂浮粪便，镜检观察卵囊形态进而鉴别感染虫种的传统方法[5]。国内采用分子生物学方法对鸡球虫进行调查的报道不多，目前仅见山东省、浙江省和安徽省有相关报道[6-9]。安徽省是养鸡大省，已有研究显示安徽省鸡球虫感染率较高[8-11]。为弥补相关报道调查地域狭窄等不足，及时反映安徽省鸡群球虫感染状况，采用分子生物学方法对安徽省多地散养鸡群球虫感染情况进行调查，以期为安徽省鸡球虫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 829份新鲜鸡粪便于2017年10月至2018年7月期间分别采集自安徽省滁州市明光市、淮南市凤台县、阜阳市太和县、宿州市埇桥区、六安市金安区、宣城市宁国市的7个散养鸡场。上述鸡场饲喂鸡用商品化饲料或自配饲料，一般添加有马杜拉霉素或地克珠利等抗球虫药物，且以前从未使用过任何球虫疫苗产品。

1.1.2 主要试剂 粪便基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；重组TaqDNA聚合酶，三羧酸脱氧核糖核苷酸混合液dNTP，DNA标志物(DNA Marker DL 2 000)，TaKaRa公司产品。

1.1.3 主要仪器 T100型梯度PCR仪、电泳仪、电泳槽，Bio-Rad公司产品；Tan2500R凝胶图像处理系统，天能公司产品。

1.2 方法

1.2.1 粪便基因组DNA提取 参照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书进行，所得DNA置-20 ℃保存。

1.2.2 艾美耳球虫的PCR扩增 7种艾美耳球虫ITS-1基因的扩增参照Lew A E等[2]的引物与方法。引物见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。两轮PCR反应体系均为25 μL，包括0.15 μL rTaq酶(5 U/μL)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.5 μL 10×PCR缓冲液，0.25 μL正反引物(20 mol/L)，模板2 μL。首轮PCR引物为艾美耳属球虫特异性引物，模板用提取的鸡粪便基因组DNA，反应条件为：预变性94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；最后72 ℃延伸15 min。第二轮PCR引物分别为7种艾美耳球虫种特异性引物，模板为2 μL首轮PCR产物，反应条件除退火温度外，其余与首轮PCR条件一致(表1)。

表1 本研究中所用的PCR引物及条件

续表1

1.2.3 PCR产物测序及分析 所有第二轮PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后，根据PCR预期扩增片段的情况来统计相应球虫虫种的感染情况。为进一步验证所获不同艾美耳球虫阳性样本的真实性，从7种鸡艾美耳球虫阳性样本中随机各挑选5个第二轮PCR扩增产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。所得序列经DNAMan v9.0软件软件进行比对和加工，在GenBank中进行Blast搜索，以验证其是否是相应鸡球虫ITS-1序列。

2 结果

2.1 多种艾美耳球虫ITS-1基因PCR扩增及序列分析

829份样本，共扩增出57份柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、172份E.acervulina、173份E.maxima、20份毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)、17份布氏艾美耳球虫(Eimeriabrunetti)、147份E.mitis和6份早熟艾美耳球虫(Eimeriapraecox)阳性样本，扩增产物大小均符合预期，见图1和图2。随机选取测序的35个艾美耳球虫ITS-1基因均测序成功，序列经分析，均为鸡7种艾美耳球虫ITS-1基因。

2.2 安徽省散养鸡艾美耳球虫感染情况

PCR检测显示，本次调查的所有散养鸡场均有球虫感染，场感染率为100%。淮南鸡场检出所有7种球虫，滁州、宿州和宣城1鸡场检出6种球虫，其余4个鸡场均检出4种鸡球虫。E.acervulina、E.maxima和E.mitis是本次调查最常见的虫种，感染率分别为20.75%、20.87%和17.73%，其次是E.praecox(7.24%)、E.tenella(6.88 %)、E.necatrix(2.41%)和E.brunetti(2.05%)。其中，E.tenella在除宿州外的其他鸡场均有检出，感染率为0～11.72%，E.acervulina在所有鸡场均有检出，感染率为10.74%～44.00%，E.maxima也在所有鸡场均有检出，感染率为10.74%～29.31%，E.necatrix在宿州、淮南、宣城1和六安4个鸡场均有检出，感染率为0～9.48%，E.brunetti除六安外的其他鸡场均有检出，感染率为0～5.17%，E.mitis也在所有鸡场均有检出，感染率为1.65%～59.26%，E.praecox在滁州、宿州和淮南3个鸡场检出，感染率为0～8.00%(表2)。混合感染很普遍，尤以E.acervulina+E.maxima，E.acervulina+E.mitis，E.maxima+E.mitis及E.acervulina+E.maxima+E.mitis混合感染较为常见，其中E.acervulina和E.maxima是最常参与混合感染的虫种(表3)。

表3 安徽省散养鸡群球虫混合感染情况

A.Mit1；B.Mit5;M.DNA 标准DL 2 000;1～7.样品

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.样品

3 讨论

对球虫感染进行定期检测与监测，是预防鸡球虫病的有效手段[3]。基于PCR的分子生物学检测方法不仅可精准鉴定不同球虫虫种，还可定量球虫感染强度及精确监测养殖环境中的球虫分布等，而且该类方法在大批量样品检测中更具优势[5]。本研究利用不同种鸡球虫ITS-1基因的套式PCR对安徽省多地散养鸡7种球虫感染情况进行调查，以期为我省散养鸡球虫病防控提供参考。

本研究中，所调查的7个鸡场均检出有球虫感染，场感染率为100%，这一结果与多个有关安徽省鸡群球虫流行的报道一致，显示安徽省鸡群球虫感染情况比较普遍[8-11]。分析其原因，可能与安徽省气候条件比较适合球虫发育及鸡场饲养管理不规范有一定的关系，尤其是散养鸡场，多采用地面平养方式，鸡场卫生条件较差，饲养管理较为粗放，鸡在地面自由采食，非常容易摄入球虫孢子化卵囊而感染。本研究中，各鸡场均有球虫检出，但鸡群并没有明显的球虫病临床症状，显示鸡群可能处于亚临床感染状态，可因增重缓慢和降低饲料报酬而造成巨大的隐性经济损失，应引起高度重视[7]。此外，本研究中安徽省散养鸡群球虫感染率很高，而本次调查的鸡群在日常养殖中均使用抗球虫药进行预防，提示在上述散养鸡群中可能存在较为广泛的球虫耐药虫株的流行[6]。

从球虫虫种的分布情况来看，本次共检获7种鸡球虫，这一结果与山东省和安徽省的相关报道一致[6,9-10]。Huang Y等[8]对安徽省规模化鸡场的调查发现存在6种球虫虫种，而浙江省及其他关于安徽省鸡群的相关报道均检出5种球虫虫种[7,11]。本研究中，E.acervulina、E.maxima和E.mitis是最常见的虫种，这一结果与山东省、浙江省及安徽省的多个相关报道不同，显示鸡球虫在不同地理区域的分布和流行不尽相同[6-11]。研究显示，拥挤效应和艾美耳球虫种间的相互作用是影响球虫卵囊产生的最重要因素，E.acervulina有最高的生殖潜力，在混合感染的情况下，E.acervulina能降低E.brunetti,E.maxima,E.tenella和E.necatrix的卵囊产量[3,8]。本研究中，E.acervulina是最频繁参与混合感染的球虫虫种，这可能是本研究中临床上危害最为严重的球虫虫种E.tenella感染率不高的一个重要原因。

综上所述，本研究显示安徽省散养鸡群中球虫的感染率较高，故应采取综合性措施加强对球虫感染的防控，E.acervulina、E.maxima和E.mitis等3种虫种是防控的重点。其次，在应用球虫药物防控球虫病时，要高度重视球虫的耐药性问题，尤其是在禁止使用化学药物的背景下，可采用中草药抗球虫或鸡球虫疫苗免疫的方法来预防球虫病[5]。