回归分析法研究大黄素对家兔十二指肠肌电作用的机制

万仕成，赵建帅，肖 妍，王 莹，刘晨熙，崔伊檬，张 金，惠乔岳，杨松桦，张莹利，武永杰，徐永平

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

大黄素(emodin)是大黄、虎杖、何首乌等常见中草药的一种重要的药用活性成分，属于天然蒽醌类衍生物[1]，广泛用于医疗、保健和日用化工品以及饲料(鱼、虾)[2]中。大黄素具有抗肿瘤[3-5]、抑菌[6-7]、免疫抑制[8]、解痉、止咳、利尿、泻下等诸多生物学作用[9-10]。蒋军等[11]分析研究文献总结大黄素对胃肠动力促进作用的可能机制包括调控信号通道(Na+、Ca2+、Cl-通路)、调节卡哈尔氏间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)、调节神经递质传递、调节胃肠道激素等。黄伟锋等[12]观察到经家兔经耳缘静脉注射大黄素后，胃肌电活动受到抑制；经中缝大核注射大黄素可抑制胃肌电活动，经苍白核注射大黄素可使胃电频率增强。近年来数学建模在构建DNA双分子模型、传染病模型、疗效评定模型等生物学领域有广泛应用[13]，有助于进一步揭示相关生物学现象的宏观调控机制[14]。大黄素对胃肠道运动的影响，是否可以通过数学建模揭示其内在规律？因此，本试验采用生物信号监测系统采集经耳缘静脉注射不同剂量大黄素对家兔十二指肠肌电活动作用的数据，并构建数学模型，旨在阐明大黄素对家兔十二指肠作用的量效关系，为揭示大黄素对十二指肠作用的内在机制以及大黄素类药物的研发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4月龄健康家兔，平均体重2.0 kg±0.3 kg，购自陕西省咸阳市武功县玉兔养殖场，保障动物福利的条件下，于干净、卫生的环境中适应性饲养1周后用于试验。

1.1.2 药物与试剂 大黄素粉剂，润友化学(深圳)有限公司产品；二甲基亚砜(DMSO)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品。参照黄伟锋等[12]的方法，使用二甲基亚砜助溶大黄素粉剂，配置成3 mg/mL的大黄素-5 mL/L二甲基亚砜生理盐水注射液。

1.1.3 主要仪器 BL-420F生物信号采集与分析系统，成都泰盟软件有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 不同剂量大黄素对家兔十二指肠肌电活动的影响 参照杜宜楠等[15]的方法，受试家兔均手术埋置电极建立十二指肠肌电活动监测动物模型。33只家兔按照大黄素剂量随机分为对照组、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15 mg/kg等10个给药剂量组。对照组使用等量的5 mL/L二甲基亚砜生理盐水溶液替代注射。监测前，待测家兔禁食禁水12 h后，通过家兔置于保定盒内，将留置的两根BV纯铜导线分别连入BL-420F生物机能实验系统，设置参数为：增益：1 mV，时间常数：1 s，滤波：10 Hz，扫描速度：2.5 s/div。观察记录波形图，待其稳定后持续监测记录肌电活动10 min，作为自身对照。经耳缘静脉注射相应剂量的3 mg/mL大黄素注射液，持续观察待波形图稳定后，记录60 min。监测过程中观察并记录家兔对药物反应的体征变化。试验完毕后拆除导线，动物置于安静清洁舒适的环境中进行饲喂，经过大黄素休药期后，保障动物福利对家兔进行处置。将所得肌电波形按照6 min记录的波形图作为一个数据样本，将所得的每个记录结果(波形图)随机采集3个数据样本，每个数据样本提取振幅(单位：mV)和频率(单位：min-1)，按照振幅乘以频率的方式，换算为肌电活动指数(单位：mV/min)。采用SPSS 20.0 软件分别对试验采集的振幅、频率以及肌电活动指数按照单因素方差分析(单因素ANOVA,Duncan)进行组间差异显著性分析，结果以“平均数±标准差”的形式表示。

1.2.2 大黄素对十二指肠肌电活动影响的数模构建与分析 基于“1.2.1”采用SPSS 20.0 软件进行的生物学统计分析的结果，利用Origin 2017软件绘制大黄素的剂量变化与肌电活动指数二者关系的散点图，分析两者可能符合的函数类型，并以其为模板，拟合出表示大黄素剂量与肌电活动指数关系最优的函数参数，进而获得函数表达式。对获得的函数表达式进行拟合精度分析，选择同样条件下函数表达式的决定系数(R2)最大且大于0.95的同时P值最小且小于0.05的最优函数表达式。根据所得函数表达式各参数的特点，分析大黄素对十二指肠肌电活动影响的作用机制。

1.2.3 大黄素对十二指肠肌电活动影响的阿托品阻断试验 基于“1.2.1”采用SPSS 20.0软件进行的生物学统计分析的结果，使用0.02 mg/kg的硫酸阿托品分别与对照组、促进或抑制作用最明显的大黄素剂量组联合作用。每个剂量组3只。采用“1.2.1”的方法建立动物模型，在测量前5 min对动物模型经肌肉注射0.02 mg/kg的硫酸阿托品，后续按照上述方法进行肌电活动监测，并进行统计学分析。

2 结果

2.1 耳缘静脉注射大黄素后家兔体征的变化

给药前各试验家兔体征均正常，耳缘静脉注射大黄素注射液后，8 mg/kg及以下剂量组家兔未见明显异常。而10 mg/kg剂量组给药后，家兔开始出现焦躁不安等症状，随着剂量增加部分家兔偶尔出现四肢抽搐、角弓反张等神经症状，给药后24 h内部分家兔甚至出现血便的消化道病理症状。表明大黄素给药剂量低于8 mg/kg时无明显毒副作用，而高剂量大黄素则可以诱发明显的神经症状，甚至造成下消化道出血的严重病理症状。

2.2 不同剂量大黄素对十二指肠肌电活动的影响

对比不同剂量大黄素对十二指肠肌电活动影响的波形示意图(图1)可以发现，当大黄素给药剂量小于5 mg/kg，肌电活动强于对照组，且波形图呈现先增大后减小的趋势；当大黄素给药剂量大于6 mg/kg，肌电活动弱于对照组，给药剂量在8 mg/kg时，肌电活动最弱。

各试验组和对照组的肌电活动指数分析结果见表1。

表1 不同剂量大黄素对家兔十二指肠肌电活动影响的统计结果

与对照组相比，5、12、15 mg/kg剂量组的十二指肠肌电活动指数差异不显著(P>0.05)；1、2、3、4 mg/kg剂量组的肌电活动表现为促进作用，肌电活动指数差异为显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)； 6、7、8、9、10 mg/kg剂量组的肌电活动表现为抑制作用，肌电活动指数差异为显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。

各相邻试验组组间差异分析表明，具有促进作用的相邻剂量组，1 mg/kg和2 mg/kg、2 mg/kg和3 mg/kg之间差异极显著(P<0.01)，4 mg/kg和5 mg/kg之间差异显著(P<0.05)，3 mg/kg和4 mg/kg组间差异不显著(P>0.05)；具有抑制作用的相邻剂量组， 6 mg/kg和8 mg/kg、8 mg/kg和10 mg/kg之间差异显著(P<0.05)，10 mg/kg和12 mg/kg、12 mg/kg和15 mg/kg组间差异不显著(P>0.05)。

1.对照组；A.1 mg/kg;B.2 mg/kg;C.3 mg/kg;D.4 mg/kg;E.5 mg/kg;F.6 mg/kg;G.8 mg/kg;H.10 mg/kg;I.12 mg/kg;J.15 mg/kg

统计分析结果表明，大黄素对十二指肠肌电活动的作用有明显的浓度依赖性。在1 mg/kg～2 mg/kg时，肌电活动指数增高；在2 mg/kg～8 mg/kg时，肌电活动活动指数持续下降，并且在6 mg/kg时大黄素的作用效果由促进变为抑制；在8 mg/kg～15 mg/kg时肌电活动有所升高但并未回到正常肌电活动(对照组)。以对照组为参照，表现为一正一反双峰型变化趋势。

2.3 大黄素对十二指肠肌电活动影响的数学模型构建与分析

根据“2.2”统计分析结果，以大黄素剂量为横坐标(x)，肌电活动指数为纵坐标(y)绘制散点图(图2)，肌电活动指数的分布趋势以对照组为基准，随大黄素剂量的增加，呈现出一正一反双峰型不对称曲线；因此选择extreme极值函数作为模板，即y=y0+A×exp{-exp[-(x-xc)/ω+1]}，采用Origin 2017软件进行双峰型函数拟合，拟合曲线图见图3。得到峰拟合1，其函数y1表达式为：y1=3.693+4.608×exp{-exp[-(x-1.821)/1.023]-(x-1.821)/1.023+1}；峰拟合2，其函数y2表达式为：y2=3.693-2.386×exp{-exp[-(x-7.832)/1.945]-(x-7.832)/1.945+1}。

图2 不同剂量大黄素与十二指肠肌电活动指数关系的散点图

图3 大黄素剂量与十二指肠肌电活动指数的双峰拟合示意图

累积峰值拟合曲线F(x)。由于大黄素0、5、15 mg/kg在峰拟合1和峰拟合2中没有数学意义，但其有实际的生物学意义。因此累积峰值拟合曲线F(x)更好反映了大黄素剂量与十二指肠肌电活动指数实际关系。因此引入阶跃函数建立累积峰值拟合曲线F(x)表达式，即F(x)=a(x)×y1+b(x)×y2。

分析函数F(x)：独立随机变量y0为3.693，参考赵建帅等[16]对y0的分析，本试验y0与自变量x(大黄素剂量)无关，表明大黄素对十二指肠肌电活动的作用是在十二指肠肌电活动内在的调控机制的基础上实现的。

当大黄素剂量小于等于5.189 mg/kg时，则F(x)=y1，大黄素对十二指肠肌电活动表现促进作用。当大黄素剂量为xτ1即1.821 mg/kg时，肌电活动指数达到最大值为8.301 mV/min；此时，大黄素剂量(x)对肌电活动指数(y)的促进作用达到最大，为参A1，即4.608 mV/min；函数的标准差ω1为1.023，说明大黄素剂量在0.798(xτ1-ω1)mg/kg～2.844(xτ1+ω1)mg/kg-1区间内，对十二指肠肌电活动有显著的促进作用。

当大黄素剂量在5.189 mg/kg～15 mg/kg时，则F(x)=y2，大黄素对十二指肠肌电活动表现抑制作用。当大黄素剂量为xτ2即7.832 mg/kg时，肌电活动指数达到最小值为1.307 mV/min；此时，大黄素剂量(x)对肌电活动指数(y)的抑制作用达到最大，为参数A2，即2.386 mV/min；函数的标准差ω2为1.945，说明大黄素剂量在5.887(xτ2-ω2)mg/kg～9.777(xτ2+ω2)mg/kg区间内，对十二指肠肌电活动有显著的抑制作用。

以上结果表明，大黄素剂量在0.798 mg/kg～2.844 mg/kg区间内，为有效促进浓度，在5.887 mg/kg～9.777 mg/kg区间内为有效抑制浓度。

2.4 大黄素对十二指肠肌电活动影响的阿托品阻断试验结果

根据统计分析结果，以未阻断的二甲基亚砜生理盐水替代组为参照，选取二甲基亚砜生理盐水替代组与2 mg/kg、8 mg/kg大黄素剂量组进行阿托品阻断试验，十二指肠肌电活动波形如图4，统计学分析见表2。与对照组相比，阻断对照组、2 mg/kg、8 mg/kg大黄素剂量组的肌电活动指数均大幅下降，差异极显著(P<0.01)；3个阻断组之间的肌电活动指数极为接近，差异不显著(P>0.05)，表明阿托品阻断了大黄素对十二指肠肌电活动的作用。

表2 阿托品联合大黄素对家兔十二指肠肌电活动的影响

1.对照组;K.阻断对照组,L.2 mg/kg;M.8 mg/kg

3 讨论

3.1 大黄素对十二指肠肌电活动作用的特点及临床意义

近年来中西医结合逐渐成为研究的重要趋向，有关大黄素对消化道的作用也有了更多的关注。郝宗艳等[17]使用大黄素(40 mg/kg)灌服消化不良小鼠7 d，发现其对胃肠运动有一定的促进作用。但高柳等[18]将大黄素作用于离体小鼠十二指肠，发现大黄素对十二指肠产生抑制作用，且抑制效果随大黄素剂量的升高而增高。卢春敬等[19]发现大黄素对豚鼠结肠产生先促进后抑制的浓度依赖性作用。叶冬梅等[20]发现大黄素对大鼠游离空肠平滑肌和结肠平滑肌的收缩有双向调节作用。本试验通过监测大黄素对电极埋置模型家兔的十二指肠肌电指标，结果表明,大黄素对胃肠道平滑肌运动作用效果具有浓度依赖性，且随大黄素剂量的增加，肌电活动指数出现了先增加后减小再增加的一正一反双峰型变化趋势。同时本试验在临床观察中发现，高剂量组部分家兔出现明显的病理症状。并且黄婉奕等[21]发现高剂量大黄素对小鼠肾脏有一定毒性,Chen Y L等[22]指出长期或大剂量使用大黄素会引起肝脏毒性。提示在临床使用大黄素类药物时，须严格控制其剂量才有可能达到治疗目的，尤其是再利用其抑制作用时需谨慎，并防范可能的副作用风险。

3.2 大黄素对家兔十二指肠肌电活动数学建模及其作用机制分析

陈鹏[23]发现大黄素可能通过影响长时程增强、谷氨酸突触传递、钙离子信号转导等多条途径发挥镇痛作用。周成华等[24]使用大黄素灌服便秘小鼠，发现其对小肠有促进作用，且与抑制Na+、K+-ATP酶有关。黄伟锋等[12]将大黄素经耳缘静脉注射于家兔，胃电活动被明显抑制，但在胃的不同部位大黄素的作用效果强度不同。当在延髓的内侧网状结构中缝大核的不同位点微量注射大黄素时，家兔胃四个部位的肌电活动呈现较为复杂的变化：P7位点注射大黄素可抑制胃的贲门部、胃底部、胃大弯与胃窦之间的肌电活动，兴奋胃窦；P8.5位点注射大黄素仅可抑制贲门部；P9.5位点注射大黄素，贲门部、胃大弯与胃窦之间和胃窦受到抑制；P11位点注射胃大弯与胃窦之间表现抑制，而贲门部、胃底部和胃窦的肌电频率变快。上述研究表明大黄素可以通过神经系统发挥作用，并且在同一器官，不同位置，作用效果不同。

本试验按照extreme极值函数为模板构建获得了以大黄素剂量为自变量，十二指肠肌电活动指数为因变量的高拟合精度的函数模型。函数分析表明独立随机变量y0为3.693，与自变量x(大黄素剂量)无关，其生物学意义是反映十二指肠肌电活动内在的调控机制。而大黄素作为次级因素对十二指肠肌电活动的作用是在十二指肠肌电活动内在的调控机制的基础上实现的。众所周知，十二指肠肌电活动的内在调控机制是基于胃肠道的间质细胞、肠神经系统、自主神经系统和中枢神经系统构成的多层级的神经网络实现的，神经系统占主导地位。因而大黄素对十二指肠肌电活动作用可能是依赖于胃肠道的多层级的神经网络实现的。

此外，与统计分析结果相比较，本试验通过对函数模型各参数的分析，更为精确、细致地描述了大黄素对十二指肠肌电活动的浓度依赖性调节作用的特征，即大黄素对十二指肠发挥明显作用的剂量范围确定为0.798 mg/kg～2.844 mg/kg(促进作用)和5.887 mg/kg～9.777 mg/kg(抑制作用)，在该范围内，大黄素剂量以0.798、1.821、2.844、5.887、7.832、9.777 mg/kg为分界点，肌电活动的变化趋势分别表现为连续的指数型增长、对数型增长、对数型降低、指数型降低、对数型降低、对数型增长以及指数型增长。该函数可作为大黄素类药物影响十二指肠运动的药效评估模型，为大黄素类药物的研发和临床上精准用药提供重要的数据依据和参考。

3.3 阿托品联合大黄素对十二指肠肌电活动的影响

阿托品是抗胆碱药，为M-受体阻断剂[25]，可与乙酰胆碱竞争副交感神经节后纤维突触后膜的乙酰胆碱M-受体，从而拮抗过量乙酰胆碱对突触后膜刺激所引起的毒蕈碱样症状和中枢神经症状。黄伟锋等[12]在家兔中缝大核微量注射阿托品可翻转大黄素作用，切断迷走神经再注射大黄素，可使抑制作用减弱或转为兴奋，提示大黄素在该位点可能是通过胆碱能途径发挥作用。本试验在硫酸阿托品分别与2 mg/kg、8 mg/kg大黄素联合用药试验结果表明，大黄素的对十二指肠的促进或抑制作用均可被阿托品阻断，提示大黄素对十二指肠的促进或抑制作用依赖于胆碱能神经。这一结果与黄伟锋等的试验结果互为验证，在不同层次和位点证实了大黄素对通过胆碱能神经系统的作用，实现调节胃肠肌电活动的作用机制。

综上所述，大黄素在其作用剂量范围内对十二指肠有低剂量促进、高剂量抑制的调节作用，且这种调节作用是基于十二指肠有一定的活动基础实现的，即大黄素只能作为调控十二指肠活动的次级因素，并且大黄素对十二指肠肌电活动的影响，可能是通过作用于胆碱能神经系统间接支配消化道平滑肌实现的。