酵母菌发酵豆粕产物培养水产用小球藻的研究

武 顺，骆淑媛，江 阳，金卫华

（武汉东湖学院生命科学与化学学院，武汉 430212）

小球藻是一种单细胞藻类，分布广泛，可利用光合作用自养或异养生活，因其营养价值高，富含蛋白质、维生素、矿物质等，且食品安全性较好，具有很好的开发应用前景，特别是在食品和饲料添加剂方面［1-3］。随着水产养殖业的兴起，小球藻越来越受到重视。研究表明，用小球藻喂食的鱼、虾等，其生长发育能得到显著改善［4］。由于小球藻的开发利用存在诸多难题（如规模化快速有效地培养等），导致小球藻在国内尚未产业化。有关小球藻的培养研究主要集中在利用无机盐培养方式［5-8］，或无机盐与有机试剂混合培养［9］，其次是使用沼液、废水和家畜粪便发酵物作为原料进行培养［10-12］。而作为饲料的小球藻，利用以上方式培养是存在问题的，无机盐培养基中含有较多的重金属离子，如常用的BG11培养液中含Cu、Mo、Co、Mn等，虽然对小球藻的生长具有促进作用，但对动物是有一定毒性的，引起动物生长发育异常甚至死亡，沼液、废水和粪便发酵物虽然有很多成分可供应小球藻生长，但难免有很多有害微生物滋生，在水产方面还会引起氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等的累积，严重影响水产品品质。在小球藻培养方面，如何做到廉价、快速、易操作和无污染，是目前面临的问题之一。酵母菌可以直接作为饲料或用于发酵饲料已有广泛的研究和应用［13］。因此，选用廉价、营养丰富的豆粕，采用酵母发酵的方式，生产的发酵液直接用于小球藻培养，除了可用作水产养殖的饵料和动物的饲料添加剂，也可作为人类的绿色食品。

1 材料与方法

1.1 材料

豆粕市售；安琪福邦酿酒酵母Ⅰ型（饲料级水产专用）；蛋白核小球藻由武汉东湖学院实验室分离纯化。

1.2 试剂

CaCl2·2H2O、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Na2CO3、H3BO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、EDTA、CuSO4·5H2O、Na2MoO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O、葡萄糖（以上化学试剂均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司），COD/总磷/总氮/氨氮水质测试包（日本共立理化学），亚硝酸盐/硫化物检测试剂盒（杭州陆恒生物科技有限公司）。

1.3 仪器

AUY120型分析天平（日本岛津公司）；i3型紫外可见分光光度计（济南海能仪器股份有限公司）、3K18型台式冷冻离心机（美国Sigma公司）；DELTA 320pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）；HQY-C-J型摇床（金坛市鸿科仪器厂）；SPX-300B-G光照恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗期器械有限公司）；CX31型普通显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的活化与豆粕发酵接种 使用液体土豆培养基31℃振荡培养活化酵母菌，离心收集菌体，菌体用无菌水清洗两次后制成同体积菌悬液（A600=0.158），用于豆粕发酵；取10 g豆粕倒入500mL锥形瓶中，加入150 mL水，混合均匀后121℃蒸汽灭菌20 min，冷却后无菌接种酵母菌悬液5 mL（2.5%的接种量），分别放在28、29、30℃摇床中恒温振荡发酵，转速为120 r/min，发酵72 h。

1.4.2 不同温度和不同培养液对小球藻生长的影响 将发酵72 h的豆粕发酵液过滤后，将滤液6 000 r/min离心10 min，取上清液，一份直接用于小球藻培养，另一份煮沸5 min除去其中大部分活菌体后即为培养小球藻用的发酵液，按表1加样后分别在25℃恒温静置培养，光照度为1 000 lx，每24 h摇瓶悬浮小球藻1次，并测定A680，连续测定9 d。

表1 小球藻培养前培养液加入量

1.4.3 不同豆粕发酵时间对小球藻生长的影响 将豆粕在28℃的发酵时间延长至3、5、7、9 d，取不同发酵时间的发酵液，按表1中1号瓶加样并培养小球藻，测连续6 d的A680，每组做3个平行试验，取平均值。

1.4.4 总氮、氨氮、亚硝酸盐、总磷、硫化物、COD、溶氧量测定 按表1中1号瓶加样培养，测连续9 d总氮含量和连续7 d亚硝酸盐、氨氮浓度，以表1中3号瓶加样培养为对照；总磷、硫化物、COD、溶氧量均按表1中1号瓶加样培养测定7 d后参数，测量方法均按相应试剂盒说明书进行。

1.4.5 豆粕发酵后消耗率的测定 在28℃接种发酵，分为4组，每组发酵时间分别为3、5、7、9 d，发酵完成后离心弃上清液，烘干残渣至恒重后准确称量，每组做3个平行试验，取平均值。豆粕消耗率=发酵后固体物质质量/发酵前豆粕质量×100%。

1.5 数据处理

数据采用SPSS 17.0软件的One-way ANOVA进行统计学分析，计算结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同发酵温度下产生的培养液经初步灭菌后对小球藻生长促进作用

从图1至图3可以看出，29℃的发酵液单独使用与结合BG11培养液，与单独使用BG11培养液相比，对小球藻的生长具有显著促进作用（P＜0.05），两种培养液同时使用时，9 d后小球藻仍有生长趋势；其次是使用28℃的发酵液单独培养，小球藻前期生长速率远远高于添加了BG11培养液（P＜0.05），后期生长比较稳定，7 d即达到生物累积量最大。与单独用BG11培养液培养小球藻相比，3个不同温度下的发酵液均表现出显著的促进作用。

图1 温度为28℃的发酵液培养的小球藻生长趋势

图2 温度为29℃的发酵液培养的小球藻生长趋势

图3 温度为30℃的发酵液培养的小球藻生长趋势

2.2 发酵液未灭菌和初步灭菌后对小球藻生长的促进作用比较

从图4可以看出，发酵液经过除菌比不除菌效果好很多，培养前5 d，两者效果无明显差异，但后4 d差异显著（P＜0.05）。

图4 温度为28℃的发酵液未灭菌和煮沸灭菌后培养的小球藻生长趋势

2.3 28℃时不同发酵时间下产生的培养液对小球藻生长促进作用

从图5可以看出，豆粕经发酵7 d后所得产物最有利于小球藻生长，培养的小球藻在第6天仍保持良好的生长状态，发酵后3、5、9 d的代谢产物对小球藻生长促进效果区别不大，在第5天后生长基本处于停止状态。

图5 不同发酵时间产生的培养液培养的小球藻生长趋势

2.4 小球藻生长过程中培养液的总氮、氨氮和亚硝酸盐浓度变化

由图6至图8可以看出，随着培养时间延长，发酵液中的总氮、氨氮和亚硝酸盐逐渐消耗完，虽然BG11中氨氮也可耗尽，但总氮和亚硝酸盐却有较高水平的残留。

图6 不同培养液培养小球藻时总氮浓度变化

图8 不同培养液培养小球藻时亚硝酸盐浓度变化

2.6 培养小球藻后培养液中与水质参数

由表2可以看出，小球藻培养过程中，能有效增加水中溶氧量，该溶氧量适合各种水产品。培养液中总磷含量偏低，藻类生长一般在有效磷含量为0.2～1.0 mg/L的范围内比较合适，总磷含量偏低的原因与快速生长繁殖的小球藻对磷的利用有关。硫化物含量略有偏高的原因考虑有3个方面因素：一是培养液中主要营养成分来自于高蛋白水解产生的硫化物；二是培养过程非无菌培养，由杂菌生长代谢产生；三是小球藻培养在较小空间进行，代谢产生的气体（如硫化氢）难以迅速挥发，在自然水域或养殖池中，硫化物含量应该会有所下降。培养液中酸碱度偏碱性，是适合水生生物生长的；培养液中COD＜15.0 mg/L，符合地表水环境质量标准Ⅰ级。

图7 不同培养液培养小球藻时氨氮浓度变化

表2 小球藻培养7 d后培养液中影响水质的各项指标

2.7 豆粕发酵后的消耗量

从表3中得出，发酵7 d后的发酵液，豆粕消耗量最大，发酵液中可溶性营养物质的含量最多。

表3 豆粕发酵时间与消耗量

3 讨论

3.1 不同温度、不同时间发酵豆粕的产物不同

在相同培养条件下，与29℃和30℃相比，28℃时的发酵产物明显利于小球藻的吸收利用（P＞0.05），在相同温度下，发酵7 d的效果最好，说明酵母菌在发酵豆粕过程中的代谢活动与温度、发酵时间密切相关。

3.2 豆粕发酵产物比BG11培养液更适合小球藻的培养

在相同培养条件下，培养小球藻9 d，BG11培养液的产率和效率是最低的。豆粕和小球藻同属植物都能进行光合作用，在细胞的化学组成上应有相似性，通过酵母菌的降解作用，豆粕中部分物资被降解成可溶性小分子或大分子，这些分子可以被小球藻直接利用合成自身物质，省去其中的能量代谢过程，BG11培养液的组成基本为无机盐分子，要成为小球藻组成成分需一系列复杂的代谢和光合作用。小球藻在发酵液中生长速率远比BG11培养液中的快，发酵液结合BG11培养液具有更好的生长促进作用，这可能是发酵液中有效成分在9 d后已经消耗殆尽，BG11培养液中存在富余养料的原因。当给予足够的发酵液时，小球藻也会持续生长，并且不断沉淀在底部，移除底部的小球藻后，培养液仍然可以继续培养至无营养状态。

3.3 豆粕发酵液在用于小球藻培养前应尽量除去其中菌体

发酵液不经煮沸直接培养小球藻，容易导致酵母菌的快速繁殖。同时，小球藻生长缓慢，甚至停止生长的现象，可能是酵母菌的大量繁殖，二次代谢消耗了培养液的大部分营养成分或种群抑制。此外，在试验中发现，如果采用在低速摇床中培养小球藻时，菌体繁殖更快，小球藻基本不能生长，因此一般采用静置培养效果比较好。

3.4 发酵液培养小球藻后，其中总氮、氨氮和亚硝酸盐的残留

豆粕发酵后，发酵液中有一定量的氨氮和亚硝酸盐，在不同温度和不同发酵时间下，发酵液中的氨氮浓度均为0.8 mg/L，亚硝酸盐浓度为0.005 mg/L，与该酵母菌的代谢特点有关，在BG11培养基配制后，可能是其中含有硝酸盐的原因，与其他试剂混合后产生了少量氨氮和较高浓度的亚硝酸盐，两种培养液在培养小球藻过程中，均出现短暂的氨氮浓度上升过程，经过5 d培养后，氨氮均已消除，发酵液培养液中亚硝酸盐在培养3 d后可以完全消除，并且在后4 d培养过程中再没有出现，而BG11培养液中亚硝酸盐虽然初期浓度降低，但后期培养始终未能消除。以上说明BG11培养液的配比存在一定缺陷，其中有富余的N不能被小球藻利用，小球藻不断生长、沉淀、再生长。此外，试验还发现，以发酵液培养小球藻，如果出现培养液中菌体大量繁殖时，氨氮及亚硝酸盐的浓度将大幅度升高，而小球藻生长受到抑制，将无法由小球藻的代谢来降低氨氮及亚硝酸盐含量。在比较复杂的环境中，如沼液、畜禽粪便发酵液中含有大量细菌，对小球藻的生长是不利的，可能生长的是其他藻类。

虽然BG11培养液对小球藻生长具有一定促进作用，但其中残留的亚硝酸盐和总氮，特别是亚硝酸盐以及较多的重金属离子的存在，对水产养殖水体会造成严重污染，可以导致水产品的直接死亡，BG11培养液不适合在水产领域直接应用；相反，豆粕发酵液经过小球藻的生长利用后，影响水质的几个重要参数均已达到Ⅱ类水质水平［14］，在培养小球藻后直接应用，试验中使用洁净的自来水，一方面可以补充部分小球藻生长所需的部分金属离子，如Ca2+、Mg2+等（其他离子均来自天然豆粕中），另一方面，自来水具有一定的杀菌抑菌功能，可以抑制有害菌的滋生，整个发酵培养过程操作简单，来源丰富而廉价，适合规模化培养小球藻。

3.5 豆粕发酵时间与营养物质累积之间的关系

发酵7 d的培养液消耗豆粕的量最大，与最能有效促进小球藻生长结果是一致的，发酵9 d后的消耗率没有发酵7 d的高，说明酵母菌在代谢过程中可以重新利用代谢产物进行再次繁殖，由于通过离心的方式将菌体质量包含在豆粕剩余量中，所以发酵液中可溶性物质是减少的，这与发酵9 d的发酵液没有发酵7 d的发酵液在培养小球藻时效果明显相符，也与未煮沸除菌的发酵液容易导致菌体大量繁殖相符。

4 小结

豆粕发酵液对小球藻生长具有显著促进作用；经豆粕发酵液培养后的水体以及小球藻不含影响水质的污染因素；豆粕发酵液培养的小球藻可以直接应用在水产养殖领域。