跌打丸中黄曲霉毒素的测定及安全性评价

于洲，孙慧珠，刘永利

(1.石家庄四药有限公司，河北 石家庄 052100；2.河北省药品医疗器械检验研究院，河北 石家庄 050227)

跌打丸收载于《中国药典》2020年版(一部)，处方有枳实、骨碎补、续断、乳香、没药、桃仁、土鳖虫等24味药，主要用于跌打损伤、筋断骨折、淤血肿痛、闪腰岔气，临床应用广泛。跌打丸是复杂的大处方复方制剂，含动物药、矿物药、植物药和树脂类等药材，针对其化学成分的定性定量研究[1-5]报道较多，亦有文献报道对跌打丸中人参的掺伪情况进行研究，以及针对易染色的高危品种红花、姜黄、血竭的染色情况[6-9]进行检查。本品处方中含有土鳖虫、桃仁，在加工、运输、贮藏过程中易发霉，产生真菌毒素[10-12]，严重影响药品安全，但还没有关于其中黄曲霉毒素情况的报道，为评价市售跌打丸中黄曲霉毒素的情况，本文建立了跌打丸中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的含量检测方法，并对在全国流通领域抽取的76批样品进行了检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱质谱联用仪(Sciex Qtrap 6500，美国AB公司)；色谱柱：Waters T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；AE240、AE163电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)；精密移液器(德国Eppendorf公司)；免疫亲和柱(北京华安麦科，3 mL)。

1.2 试药 甲醇、乙腈、乙酸铵为色谱纯(德国默克)，水为超纯水，氯化钠为分析纯。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合对照溶液 (中检院提供，批号：610001-201301，其中AFB11.04 μg·mL-1、AFB20.35 μg·mL-1、AFG11.18 μg·mL-1、AFG20.59 μg·mL-1)；76批跌打丸样品抽取自全国28个省的流通领域。

2 方法与结果

2.1 色谱质谱条件 Waters T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱，流动相为10 mmol·L-1醋酸铵溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱(0～6 min，65%A→35%A，35%B→65%B)。流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃。以三重四极杆串联质谱仪检测；电喷雾离子源(ESI)，采集模式为正离子模式；采用多反应监测模式(MRM)采集质谱数据，各化合物监测离子对和碰撞电压(CE)见表1。

表1 质谱参数

2.2 混合对照品溶液制备 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。再用70%甲醇稀释成含黄曲霉毒素B2、G2浓度为0.02～3 ng·mL-1，含黄曲霉毒素B1、G1浓度为0.06～10 ng·mL-1的系列对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品适量，剪碎，取约5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min(搅拌速度大于11 000 r·min-1)，离心10 min(离心速度2 500 r·min-1)，精密量取上清液10 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心15 min(离心速度8 000 r·min-1)，精密量取上清液20 mL，通过免疫亲合柱，流速每分钟3 mL，用水20 mL洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用约1.5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法学研究

2.4.1 系统适用性试验 分别取混合标准品溶液、供试品溶液及加样回收试验样品溶液按照正文方法制备的供试品溶液，进样分析。结果各成分峰形较好，与相邻杂质分离度良好，结果见图1。

2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取不同浓度的混合对照品溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立各组分的标准曲线，结果见表2，表明各成分在各自线性范围内线性关系良好。

表2 黄曲霉毒素各成分标准曲线表

2.4.3 重复性试验 取跌打丸样品(批号：180903)，分别称取5 g，共6份，精密称定，置具塞三角瓶中，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按正文方法测定。结果检出G1、B1，见表3，RSD均小于5%，结合回收率试验中各成分RSD均小于5%，表明方法重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.4.4 回收率试验 取跌打丸样品(批号：180903)，分别称取5g，共6份，分为两组，精密称定，置具塞三角瓶中，各组分别精密加入黄曲霉毒素混合标准品溶液贮备溶液0.25、0.5 mL，照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按正文方法测定。计算回收率，结果见表4～7，平均回收率为88.2%～100.9%，RSD为3.9%～4.8%。表明方法回收率较好。

表4 黄曲霉毒素B1回收率试验结果

2.4.5 检测限 取经检测不含黄曲霉毒素的样品为空白基质，取5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入黄曲霉毒素混合标准品溶液贮备溶液0.01 mL，照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按正文方法测定，色谱峰信噪比约为3∶1，表明黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限分别为0.2、0.1、0.2、0.1 μg·kg-1。

1.黄曲霉毒素G2;2.黄曲霉毒素G1;3.黄曲霉毒素B2;4.黄曲霉毒B1图1 混合对照品及阳性样品色谱图

表5 黄曲霉毒素B2回收率试验结果

3 样品测定及限度制定

按拟定方法测定，对76批次跌打丸样品进行检验，结果只有一家生产企业的3批次样品中检出黄曲霉毒素G1、B1，均未超过限度(根据《中国药典》2020年版黄曲霉毒素B1不超过5 μg·kg-1，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的总量不超过 10 μg·kg-1)，结果见表8。

表6 黄曲霉毒素G1回收率试验结果

表7 黄曲霉毒素G2回收率试验结果

表8 部分样品测定结果( μg·kg-1)

4 讨论

4.1 安全性评价 此次在全国抽取的76批次样品来自9个生产企业，涵盖了全国省、市、县三级流通领域，样品测定结果基本代表了全国市场上跌打丸质量情况。测出阳性样品的A企业共抽取16批样品，只有3批样品检出B1、G1，两者总量均小于5 μg·kg-1，其余企业样品均未检出，表明跌打丸黄曲霉毒素风险较小。

4.2 跌打丸中所有药味均为原粉入药，检测阳性的3批样品推断可能是生产用原药材产生霉变所致，因此建议监管部门加大对饮片的监督力度，特别是易污染黄曲霉毒素的品种，如土鳖虫、桃仁等，为用药安全提供有力保证。

4.3 取样量及稀释过程选择 为考察样品处理过程对各待测成分含量的影响，采用加样回收法，考察不同处理过程对回收率的影响，如取样量、稀释倍数等，结果表明，取样量与回收率成反比，为保证取样均匀，选定取样量为5 g；同样稀释倍数增加有利于待测成分的准确度，因此在用水稀释过程，吸取上清液体积为10 mL。