基于Nrf2-Notch1信号轴探讨黄芩苷对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元氧化应激的影响

孙平鸽 李坤彬 李娜 吴志远 李小杏 温小鹏 方桦 吴少璞

1.郑州大学附属郑州中心医院 郑州 450006 2.郑州市第七人民医院 3.河南省人民医院

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是临床常见的中枢神经系统退行性疾病，以中老年人群为高发人群，近年来随着我国人口老龄化加剧，PD发病率逐年升高[1]。目前，临床尚无治疗PD的理想方法，多采用对症干预治疗，效果不甚理想，因此探究PD发病机制并寻找有效治疗药物具有重要意义。病理学研究显示，黑质多巴胺能神经元（dopaminergic neurons，DN）进行性丧失是PD的主要病理改变，而氧化应激是DN损伤的机制之一[2]。损伤导致氧化应激相关因子丙二醛（malondialdehyde，MDA）、 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）等表达紊乱，最终诱导DN凋亡，影响神经功能。

核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）-Notch1信号轴在氧化应激损伤过程中发挥重要调控作用，参与多种器官、组织及细胞的氧化应激损伤过程。黄芩苷（baicalin，BA）是从传统中草药黄芩中提取的有效活性成分，具有清除自由基、抗谷氨酸毒性等作用[3]。已有研究证实，BA对脑缺血再灌注大鼠神经功能具有保护作用，并能够拮抗离体神经细胞氧化应激损伤[4]。BA抗氧化作用显著，但其对PD的神经保护作用及相关机制研究尚少，因此本研究拟通过制备PD大鼠模型，观察BA对PD大鼠黑质DN氧化应激损伤相关因子及对Nrf2-Notch1信号轴的调控作用，初步阐明其调控机制，以期为PD的防治提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康无特定病原体动物（specific pathogen free，SPF）级雄性SD大鼠60只，7周龄，体质量180～220g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司[实验动物生产许可证号码：SCXK （京）2019-0020]，饲养于郑州大学实验动物中心[实验动物使用许可证号码：SYXK（豫）2020-0008]，实验过程符合减少（reduction）、替代（replacement）和优化（refinement）的3R原则。

1.2 主要试剂和仪器 BA（含量＞99%）购于南京泽朗医药科技有限公司（批号：20170310）；Nrf2通路抑制剂Brusatol购于成都植标化纯生物技术有限公司（批号：PCS1050）；Notch1通路抑制剂γ分泌酶抑制剂DAPT购于瑞士Alexis公司（批号：ALX-270-416-M005）；MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所（批号：A003-1-2、A001-1-1、A005-1-2）；TdT介导的dUTP缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒、总RNA提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（批号：T2190、R1200）；Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司（批号：15596-018）； 二喹啉 甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0009）；兔抗大鼠Nrf2、血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，Hmox1）、Notch1、Split多毛增强子1 （hairy and enhancer of Split 1，Hes1）一抗均购于美国Abcam公司（批号：ab89443、ab13248、ab128076、ab137530）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗购于美国CST公司（批号：7074）。 StepOnePlus型实时荧光定量多聚酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR）仪购于美国Thermo Fisher公司；CheniDoc XRS型化学发光成像分析系统为美国Bio-rad公司产品。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组 大鼠麻醉后仰卧位固定，参照脑立体定位图谱标注注药点：（1）右侧脑黑质：硬膜下7.0mm，矢状线右2.5mm，前囟后5.0mm；（2）前脑内侧束：硬膜下7.5mm，矢状线右2.5mm，前囟后1.0mm。以牙科钻在标注点钻直径2mm的孔，60只大鼠中随机选择50只，采用微量注射器分别于注药点注射浓度为4g·L-1、含0.02%抗坏血酸6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）溶液，各点2.5μL，注射速率1μL·min-1；其余10只设为对照组，分别于坐标点注射含0.02%抗坏血酸的0.9%氯化钠溶液，各点2.5μL，操作方法同前。术后2周，每只大鼠腹腔注射0.5mg·kg-1阿扑吗啡，10min后开始观测大鼠旋转行为，以30min内左侧旋转圈数超过210圈为建模成功[5]。共36只大鼠建模成功，将建模成功大鼠随机分为模型组、BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组，每组各9只，并将10只未制备模型的大鼠设为对照组。

1.3.2 干预方法 根据《药理实验方法学》[6]计算得出大鼠BA的临床等效剂量为78mg·kg-1，BA组以78mg·kg-1的BA 0.9%氯化钠溶液灌胃，模型组和对照组以等量0.9%氯化钠溶液灌胃，同时均以0.9%氯化钠溶液2mL·kg-1腹腔注射，1次/d， 连续2周；BA-Nrf2抑制剂组在BA组基础上腹腔注射Brusatol 2mg·kg-1，BA-Notch1抑制剂组在BA组基础上腹腔注射DAPT 10mg·kg-1，1次/d，连续2周。

1.3.3 组织取材 干预结束后，每组选择4只大鼠进行麻醉，立即用4%多聚甲醛进行心脏灌流，分离全脑组织，置于4%多聚甲醛中固定备用；每组余下5只大鼠处死，分离全脑组织，于冰面上剥离双侧脑黑质，取部分制备成10%组织匀浆，-70℃冻存备用，其余部分脑黑质直接于-70℃冻存备用。

1.3.4 脑黑质氧化应激指标检测 取10%脑黑质组织匀浆液，4℃下3 000r/min离心10min，离心半径10cm，取匀浆上清液，参照试剂盒说明书步骤操作，采用硫代巴比妥那比色法检测MDA水平，邻苯三酚自氧化法检测SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-Px活力。

1.3.5 脑黑质DN细胞凋亡情况检测 取4%多聚甲醛中固定的全脑组织，将脑黑质部分常规石蜡包埋，5μm切片，脱蜡至水，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤操作，3，3-二氨基联苯胺（diaminobezidin，DAB）法显色，苏木素复染、常规脱水及透明后晾干，中性树脂封片。光镜下观察拍照，以染成棕黄色或棕色的细胞为凋亡阳性，取5个随机视野，计数200个细胞，计算细胞凋亡率，取平均值。

1.3.6 脑黑质Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA表达检测 取-70℃保存的脑黑质组织，Trizol法提取总RNA，逆转录获得cDNA，以之为模板链进行Realtime PCR，按照试剂盒说明书设定反应体系，经42个循环扩增后，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 为 内 参照，采用2-△△CT法计算为目的基因的相对表达量。引物设计和合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.7 脑黑质中Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1蛋白表达检测 取-70℃保存的脑黑质组织，经研磨、裂解后进行蛋白定量，沸水水浴变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经封闭及一抗、二抗孵育，进行电化学发光法显影和定影，凝胶成像系统扫描，以目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料均以±s表示，多样本间比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较 干预期间对照组大鼠全部存活，未发生旋转行为，一般状态无异常。模型组大鼠毛色发黄，进食量明显减少，出现旋转、惊厥等症状，并随时间的延长逐渐加重，部分出现濒死状态。BA组毛色发黄稍减轻，进食量稍有增加，旋转、惊厥等症状有所减轻，但仍较对照组明显。BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组症状较BA组更重，但较模型组稍减轻，较少出现惊厥或濒死状态。

2.2 各组大鼠脑黑质中MDA、SOD活力及GSH-Px水平比较 与对照组比较，模型组、BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组MDA水平较高，SOD和GSH-Px活力均较低（P＜0.05）。 与模型组比较，BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组MDA水平降低，其中BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组高于BA组（P＜0.05）；与模型组比较，BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组SOD和GSH-Px活力均升高，其中BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组低于BA组 （P＜0.05），BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组MDA、SOD及GSH-Px水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

表2 各组大鼠脑黑质MDA水平、SOD及GSH-Px活力比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of MDA level， SOD and GSH-Px activity of substantia nigra in each group（±s，n=5）

表2 各组大鼠脑黑质MDA水平、SOD及GSH-Px活力比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of MDA level， SOD and GSH-Px activity of substantia nigra in each group（±s，n=5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与BA组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group， *P＜0.05;compared with model group， #P＜0.05;compared with BA group， △P＜0.05

组别 MDA（mmol·mg-1） SOD（U·mg-1） GSH-Px（U·mg-1）对照组 2.10±0.51 175.26±16.87 80.59±10.24模型组 6.80±0.70* 90.22±13.91* 23.75±6.10*BA 组 3.74±0.63*# 151.30±15.87*# 65.20±8.35*#BA-Nrf2 抑制剂组 5.07±0.75*#△ 122.78±16.02*#△ 38.25±8.91*#△BA-Notch1 抑制剂组 5.19±0.84*#△ 123.51±15.14*#△ 37.43±7.44*#△

2.3 各组大鼠脑黑质DN凋亡情况比较 对照组、模型组、BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组脑黑质DN凋亡率分别为（9.25±2.10）%、（43.80±2.05）%、（20.26±2.18）%、（35.46±2.25）%、（36.81±2.19）%。 与对照组比较，模型组、BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BANotch1抑制剂组脑黑质DN凋亡率均较高（P＜0.05）；与模型组比较，BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组脑黑质DN凋亡率均降低，其中BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组高于BA组，差异均有统计学意义（P＜0.05），BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠脑黑质DN凋亡情况（TUNEL染色，400×）Fig.1 Apoptosis of DN in substantia nigra in each group(TUNEL staining， 400×)

2.4 各 组 大 鼠 脑 黑 质 中Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA表达比较 与对照组比较，模型组、BA组、BANrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA相对表达量均较低（P＜0.05）；与模型组比较，BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA相对表达量均升高，其中BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组低于BA组，差异均有统计学意义（P＜0.05），BANrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

表3 各组大鼠脑黑质Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA相对表达量比较（±s，n=5）Tab.3 Comparison of the relative expressions of Nrf2， Hmox1， Notch1， Hes1 mRNA of substantia nigra in each group（±s，n=5）

表3 各组大鼠脑黑质Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA相对表达量比较（±s，n=5）Tab.3 Comparison of the relative expressions of Nrf2， Hmox1， Notch1， Hes1 mRNA of substantia nigra in each group（±s，n=5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与BA组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group， *P＜0.05;compared with model group， #P＜0.05;compared with BA group， △P＜0.05

组别 Nrf2 Hmox1 Notch1 Hes1对照组 1.05±0.07 0.95±0.08 1.23±0.09 1.10±0.08模型组 0.32±0.04* 0.23±0.04* 0.54±0.06* 0.40±0.05*BA 组 0.84±0.08*# 0.80±0.06*# 0.95±0.07*# 0.86±0.06*#BA-Nrf2 抑制剂组 0.45±0.06*#△ 0.37±0.04*#△ 0.67±0.05*#△ 0.55±0.05*#△BA-Notch1 抑制剂组 0.49±0.06*#△ 0.40±0.05*#△ 0.63±0.05*#△ 0.51±0.04*#△

2.5 各组大鼠脑黑质中Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1蛋白表达比较 与对照组比较，模型组、BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1蛋白相对表达量均较低（P＜0.05）； 与模型组比较，BA组、BA-Nrf2抑制剂组及BA-Notch1抑制剂组Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1蛋白相对表达量均升高，其中BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组低于BA组，差异均有统计学意义（P＜0.05），BA-Nrf2抑制剂组和BA-Notch1抑制剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组大鼠脑黑质中Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1蛋白表达情况Fig.2 Expressions of Nrf2， Hmox1， Notch1 and Hes1 of substantia nigra in each group

3 讨论

PD病因及发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明。研究认为，环境毒素、家族遗传、免疫系统异常及氧化应激均与PD发病相关[7-8]。近年来研究证实，DN变性坏死是PD的主要病理改变，DN缺乏可导致纹状体多巴胺分泌减少，从而引起DN与胆碱能神经元功能失调，进而引发一系列临床症状[9]。PD一旦发病，需终身干预，目前临床上主要采用多巴胺受体激动剂、多种酶抑制剂等进行治疗，改善临床症状的近期效果较好，但长期用药不良反应较强，而且无法逆转DN进行性丧失的病理改变[10]。氧化应激损伤是DN凋亡主要机制之一，寻找高效低毒的药物，抑制DN氧化应激损伤现已成为PD治疗研究的新方向。

近年来中医药在多种慢性疾病的治疗中表现出较大优势，逐渐成为临床和基础研究的热点[11]。BA是从黄芩中提取的黄酮类小分子化合物，水解后可通过血脑屏障，具有显著的抗氧化应激作用。本研究应用BA干预后PD模型大鼠的症状减轻，脑黑质MDA水平低于模型组，SOD、GSH-Px活力高于模型组，提示BA可有效改善PD大鼠脑黑质DN氧化应激损伤。李慧艳等[12]研究发现，BA可有效降低急性胰腺炎大鼠血清MDA水平，升高SOD、GSH-Px活力；另有研究显示，BA可有效减轻创伤性脑损伤小鼠脑皮质氧化应激损伤，说明BA具有抗氧化应激作用[13]。以上两项研究与本研究结果一致。本研究进一步显示，BA干预后PD大鼠DN凋亡率较模型组降低，提示BA可有效抑制PD大鼠DN凋亡，与Zheng等[14]研究结果相似。该研究提示BA干预后，类神经元PC-12细胞受氧化应激诱导的凋亡减少，说明BA可减轻氧化应激损伤，具有细胞保护作用。

Nrf2-Notch1信号轴是机体氧化应激反应中重要的信号转导途径，其中Nrf2信号通路与Notch1信号通路相互作用、相互影响，共同参与神经系统退行性病变、肿瘤等疾病的发生和发展。Hes1是Notch1通路下游关键位点之一，已有研究证实，Notch1/Hes1信号通路抑制与糖尿病视网膜神经元损伤关系密切[15]。Nrf2含有亮氨酸拉链蛋白，在氧化应激反应中发挥关键作用，Hmox1是其下游靶蛋白[16]。Nrf2信号通路在细胞氧化应激损伤过程中的调控作用已有报道。Moreira等[17]发现Nrf2信号通路在PD小鼠模型中可诱导脑黑质致密部DN的缺失，诱导氧化应激损伤。Sampath等[18]研究表明Nrf2信号通路抑制可抑制PD小鼠的胃肠组织中抗氧化基因的表达，从而导致胃肠运动功能障碍。Yamaguchi等[19]研究显示，Notch1-Nrf2轴在肌源性干细胞中参与了抗氧化调控过程，Notch1作为Nrf2上游通路发挥作用，以辅助维持肌源性干细胞的自我更新能力及表型。目前Notch1-Nrf2轴在神经元中的抗氧化能力研究报道尚少。本研究结果提示，与对照组比较， 模型组Nrf2、Hmox1、Notch1、Hes1 mRNA和蛋白相对表达量降低，说明PD大鼠Nrf2-Notch1信号轴被抑制；应用BA干预后，BA组上述指标较模型组升高，说明BA可能通过激活Nrf2-Notch1信号轴发挥抗氧化应激损伤作用；在BA基础上分别应用Nrf2抑制剂和Notch1抑制剂干预后，上述指标较BA组均降低，且脑黑质中SOD、GSH-Px活力也较BA组降低，MDA水平及DN凋亡率较BA组升高，进一步证明BA可通过激活Nrf2-Notch1信号轴，发挥抗氧化应激损伤作用。

综上所述，BA可有效改善PD大鼠脑黑质DN氧化应激损伤，其机制可能与激活Nrf2-Notch1信号轴，发挥调控作用有关。本研究结果可为临床中BA及其相关药物用于PD的防治提供理论依据。