基于成分含量和生态因子的浙贝母品质区划研究

吴嘉利 张小波 胡杰 李梦 景志贤 袁强 李石清 张春椿

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.中国中医科学院 中药资源中心 3.杭州第一技师学院

浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）是百合科（Liliaceae）植物浙贝母的干燥鳞茎，为我国常用的传统中药材，原产地为宁波象山，是著名的“浙八味”之一[1]，其性寒，味苦，归肺、心经，具有清热化痰止咳、解毒散结的功效，在临床上广泛应用，常用于治疗风热咳嗽、痰火咳嗽、肺痈、乳痈、瘰疬、疮毒等疾病[2]。现代药理学研究表明，浙贝母主要药用成分为贝母素甲、贝母素乙等生物碱类[3-5]。

中药区划是指以中药资源和中药生产地域系统为研究对象，通过分析中药资源区域分布和中药生产特征，依据区域相似性和区级差异性原理，将全国划分成不同等级的区域，以指导中药资源保护管理、开发利用和中药生产[6-7]。中药材生产适宜性区划是利用地理信息系统（Geographic Information System，GIS）的叠加分析等功能，在生态适宜性的基础上，结合全国中药资源空间信息网络数据库中的信息，对区域进行划分[8]。近年来，中药资源需求飞速增长，大量中药材道地产区的经济及生态环境发生重大改变，部分药材产地也在发生变迁，但盲目引种和扩种可能影响中药材质量。特定的生态环境是道地药材形成的重要条件，因此在引种、扩种前需要对中药材生产进行合理布局，以促进中药材产业的可持续发展[9]。浙贝母就是一个典型的例子，随着浙贝母种植面积的迅速扩大，种植地土壤和气候因素的变化，浙贝母质量存在不稳定性。毛剑飞等[10]研究表明，平均气温在17℃左右时，地上部茎叶生长迅速；超过20℃，生长缓慢并随气温继续升高而枯萎；高于30℃或低于4℃则生长停止；而地下鳞茎于10～25℃时正常膨大，高于25℃地下鳞茎进入休眠，-6℃鳞茎受冻。浙贝母喜欢湿润气候，所需土壤最佳含水量在20%～30%，用带沙质的轻黏土栽培最佳[11]。笔者团队于浙贝母主产区浙江和江苏两省采集浙贝母鲜品，通过统计分析得到主导因子，并利用GIS技术对浙贝母品质进行区划研究，这将有利于为浙贝母的种植规划和基于化学成分含量的生产布局提供科学依据[12]。

1 材料和方法

1.1 药材样品和生态环境数据 2020年5月分别于浙江省和江苏省的32个样点采集浙贝母药材，每个样点3株，并记录药材样品采集地的经纬度和海拔等位置信息。

通过中国中医科学院中药资源中心“中药资源空间信息网络数据库”获取浙江省和江苏省的生态因子数据。其中气候因子来自全国气候数据网站，系通过全球已有的最新气候站点数据，采用经度、纬度和海拔三维地理空间进行插值得到的，空间分辨率为1km2。

1.2 试剂和仪器 贝母素甲（色谱纯）、贝母素乙（色谱纯）对照品均购于上海诗丹德生物技术有限公司（批号：ST00370120MG、ST00380120MG）；甲醇（分析纯）购于天津科密欧化学试剂有限公司（批号：20150702）；三氯甲烷（分析纯）购于西陇化工股份有限公司（批号：20150521）；甲醇（色谱纯）购于天津四友精细化学品有限公司（批号：503332-09547）；纯净水选用娃哈哈纯净水。Waters1525高效液相色谱仪和Empower2色谱工作站均购于美国Waters公司；Hypersil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）购于大连依利特分析仪器有限公司；SEDEX LT-ELSD型蒸发光散射检测器为北京迪科马科技有限公司产品；KQ2200DA型数控超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司；AR224CN电子分析天平为奥豪斯仪器上海有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 生物碱成分含量的测定

1.3.1.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为A（乙腈）和B（0.05%三乙胺-水），梯度洗脱0～5min，55%A；5～7min，55%～75%A；7～18min，85%A，流速为1mL·min-1，柱温30℃，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection，HPLC-ELSD）检测。漂移管温度55℃，载气40psi，增益10。

1.3.1.2 供试品溶液制备 取采集的浙贝母供试品粉末约2.0g，过4号筛，精密称量，并置于锥形瓶中，加入浓氨水4mL，浸润30min，再精密加入氯仿-甲醇（4:1）的混合溶液40mL，精密称重，混匀。将上述溶液置于超声器中超声1.0h，静置冷却，再次称重后，加入上述混合溶液补足重量，滤过。精密量取滤液10mL，置于蒸发皿中蒸干，以甲醇溶解后转移至5L容量瓶中，再以甲醇定容并摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，静置备用。

1.3.1.3 对照品储备液制备 取贝母素甲、贝母素乙对照品适量，精密称定后加入甲醇溶液，制成1mL含贝母素甲0.20mg、贝母素乙0.29mg的混合对照品储备液。

1.3.1.4 线性关系考察 分别准确吸取混合对照品储备液适量，以甲醇稀释定容后，得到5个不同质量浓度的混合对照品溶液。在本实验的色谱条件下，分别对各质量浓度对照品溶液进行进样分析，按上述条件测定峰面积。并以对照品溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

1.3.1.5 供试品测定 取不同产地浙贝母供试品粉末，按1.3.1.2中的方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，用标准曲线法分别计算各供试品中贝母素甲、贝母素乙的含量。

1.3.2 浙贝母分布区划 基于浙贝母分布信息和浙江省与江苏省的中药资源普查实地调查数据库[13]，获取浙贝母的分布信息，利用最大信息熵模型的迭代运算，进行浙贝母潜在分布区划。对有异议的区域进行验证核实，完成浙贝母分布区划图制作[14]。

1.3.3 浙贝母品质区划 中药品质区划是以中药品质评价指标为基础，采用逐步回归、相关分析等统计学方法，分析中药材品质评价指标与生态因子之间的相关性，并构建品质评价指标与生态因子之间的关系模型[15]。

本文以浙贝母中贝母素甲、贝母素乙两种生物碱的含量作为品质评价指标，应用SPSS 19.0统计软件进行相关性分析，从而研究两种生物碱与生态因子之间的相关性；再利用逐步回归分析，研究并构建贝母素甲和贝母素乙与生态因子之间的关系模型。基于关系模型，应用Arc地理信息系统（Arc Geographic Information System，ArcGIS）10.2的栅格计算方法，估算全国范围内浙贝母中两种生物碱的空间分布情况。

2 结果

2.1 样品和生境信息 通过实地调查，共获得浙江和江苏两省共96份样品的地理位置信息，4个土壤数据（含沙量、含黏土量、土壤类型、质地类型）和16个气候因子数据（年均降水量、昼夜温差月均值、相对湿度、等温线、辐射、日照、1～5月平均气温和1～5月平均降水量）。

2.2 生物碱含量的测定

2.2.1 高效液相色谱分离 精密吸取混合对照品和供试品溶液各20μL，在1.3.1.1中的色谱条件下进行含量测定，得到混合对照品和供试品的色谱图。见图1、2。结果表明，该色谱条件对混合对照品及供试品所测的贝母素甲和贝母素乙的分离效果较好，均达到基线分离，且基线平稳。

图1 混合对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of test sample

2.2.2 线性关系考察 通过计算得到贝母素甲的回归方程y=1.6859x+6.6653，R2=0.9994，表明贝母素甲质量浓度在0.00596～0.1192mg·mL-1范围内，供试品浓度和贝母素甲峰面积之间具有良好的线性关系；贝母素乙的回归方程y=1.7053x+6.5894，R2=0.9994，表明贝母素乙质量浓度在0.0412～0.0824mg·mL-1范围内，供试品浓度和贝母素乙峰面积之间具有良好的线性关系。见表1。

表1 贝母素甲、贝母素乙的线性关系考察Tab.1 Study on the linear relationship between peimine and peiminine

2.2.3 不同产地浙贝母中生物碱含量 浙江省共12个产地的浙贝母符合药典要求，江苏省9个产地的浙贝母符合药典要求，其余11个产地的浙贝母中贝母素甲、贝母素乙的总含量小于0.08%，未达到药典要求。见表2。

表2 不同产地浙贝母样品中贝母素甲和贝母素乙的含量（%）Tab.2 Contents of peimine， peiminine in Fritillaria thunbergii Miq.from different places（%）

2.3 浙贝母分布区划 通过实地调查，获得两个省份32个产地的浙贝母地理分布数据，并利用最大信息熵模型，计算得到浙贝母的空间分布概率区划图。见图3。由图3可知，浙贝母分布适宜度较高的区域在浙江中东部和北部，以及江苏的东部。

图3 浙贝母空间分布区划Fig.3 Spatial distribution division of Fritillaria thunbergii Maximum information entropy distribution

2.4 浙贝母品质区划 基于样品的地理位置、土壤以及气候因子数据，应用SPSS 19.0统计软件，采用相关性分析法，对32个采样点的贝母素甲、贝母素乙含量与气象因子之间的相关性进行分析，结果表明贝母素甲含量与年均降水量、月昼夜温差、相对湿度及月平均气温显著相关；贝母素乙含量与年均降水量、相对湿度显著相关。

分别设贝母素甲为Y1，贝母素乙为Y2，相对湿度为X1，年均降水量为X2，月昼夜温差为X3，月平均气温为X4，采用逐步回归分析法，对贝母素甲、贝母素乙含量与年均降水量、月昼夜温差、相对湿度、月平均气温等环境因子间的关系进行分析，构建化学成分与生态因子的关系模型。结合ArcGIS 10.2软件的空间计算功能，估算各个有效成分的空间分布情况，贝母素甲、贝母素乙的空间分布情况结果分别见图4、5。

图4 贝母素甲含量空间分布Fig.4 Spatial distribution of content of peimine in Fritillaria thunbergii Miq.

回归方程Y1=0.003+1.081×10-5X1-6.440×10-7X2-1.264×10-5X3-7.814×10-6X4（Y1：贝母素甲，X1：相对湿度，X2：年均降水量，X3：月昼夜温差，X4：月平均气温），R2=0.645，模型拟合程度较好，故可以进行贝母素甲的含量预测。

回归方程Y2=0.001+5.587×10-6X1-4.470×10-7X2（Y2：贝母素乙，X1：相对湿度，X2：年均降水量），R2=0.370，模型拟合程度较好，故可以进行贝母素乙的含量预测。

2.5 浙贝母质量适宜分布区 应用ArcGIS 10.2软件的空间计算功能，以全国740个气象站的气象数据为基础，根据浙贝母中贝母素甲、贝母素乙和气象因子的关系模型，估算浙江和江苏两省范围内浙贝母中的贝母素甲和贝母素乙的含量。同时，以贝母素甲和贝母素乙总量大于0.08%作为适宜区的标准，将其分为适宜区和不适宜区。见图6。

图5 贝母素乙含量空间分布Fig.5 Spatial distribution of content of Peiminine in Fritillaria thunbergii Miq.

图6 浙贝母适宜分布区Fig.6 Suitable distribution area of Fritillaria thunbergii Miq.

3 讨论

相关研究表明，不同地区的浙贝母品质存在一定差异[16-17]。本课题组采集浙江省和江苏省32个产地的浙贝母，对浙贝母中贝母素甲和贝母素乙的成分含量进行分析研究。结果表明不同产地所产浙贝母中生物碱的含量差别较大，江苏和浙江两省共21个产地的浙贝母中生物碱含量符合药典要求，其余11个产地的浙贝母中贝母素甲、贝母素乙的总含量可能因为土壤中微量元素较少，水分、日照不充足等原因没有达到药典要求。因此，选取生态因子与最适宜条件相似性高的地区发展种植，才能有效保证药材品质。

贝母素甲含量较高的浙贝母分布区集中在浙江中东部；贝母素乙含量较高的浙贝母分布区集中在浙江省东部和浙江、江苏交界处，这与浙贝母产地的地形条件、气候条件等生态因子息息相关。浙贝母的栽培及引种应该首先综合考虑年均降水量、月昼夜温差、相对湿度、月平均气温这四个主导因素，浙江省的东部及北部和江苏省的东部是浙贝母分布的适宜生长区域，以上结果可以为浙贝母的规范化种植和引种提供科学依据。

根据以上结论，最适宜的中药分布区是先确定中药材产地的环境因子和中药品质之间的关系模型，利用GIS技术，再根据面状生态环境数据和关键模型进行空间计算，最后获得品质评价指标的空间分布情况[18-19]。该研究可为提升种植产业结构、改善人工栽培手段、增强资源可持续利用提供扎实的理论依据，并为后续浙贝母的综合发展提供可靠的基础。