原发性高血压患者血压昼夜节律与内皮微粒水平的关系△

范景如，陈翠萍，陈子清，郭舜奇

［汕头市中心医院（中山大学附属汕头医院）急诊科综合病区，广东汕头515031］

中国高血压调查（CHS）［1］发现，我国成人（≥18 岁）原发性高血压（高血压）患病率为27.9%，达2.45 亿，患病率随年龄增加而升高。高血压引起动脉粥样硬化及心、脑、肾等靶器官的损伤是一个渐进的过程，而血管内皮的损伤与功能失调是动脉粥样硬化的始动环节［2］。已有多个国内外研究证实高血压患者血循环中内皮微粒（endothelin microparticle，EMP）水平升高且与高血压严重程度相关［3-5］，是作为体内炎症反应介导的内皮损伤的特异性指标［6-7］和高血压动脉硬化程度的血液学指标［8］。人的血压在神经、体液等多种因素调节存在昼夜节律，呈“两峰一谷”的“杓型”模式，即血压昼夜节律（blood pressure circadian rhythm，BPCR）。BPCR 可通过24 h 动态血压监测（ambulatory blood-pressure monitoring，ABPM）检测出来。目前已有多个指南推荐ABPM 作为评价高血压患者降压真正达标的重要补充，并明确患者的血压变异性［9-11］。BPCR 的变异被认为与高血压患者心脑血管事件发生率和病死率密切相关，是独立的预测因子［12-13］。研究发现高血压患者的夜间血压控制达标能显著降低心血管事件的发生率［14］。基于高血压患者血流中的EMP 水平是反映动脉粥样硬化的血液指标，以及BPCR 消失为心脑血管事件发生的独立预测因素，本文通过研究高血压患者血循环中EMP 水平与BPCR 变异的关系，探讨EMP 在高血压患者动脉硬化中所起的病理生理学作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2019 年3 月至2020 年9 月期间于汕头市中心医院高血压门诊就诊及综合病区（高血压专科）住院的高血压患者，年龄为30～75 岁。所有患者均达到《中国高血压防治指南2018》高血压诊断标准：收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg［11］；且尚未服降压药或至少入组前2 周内未服过任何降压药。入院后完善ABPM 检查。所有入组患者均需排除：继发性高血压、糖尿病、近期急性或慢性炎症或手术史、恶性肿瘤或自身免疫性疾病、脑血管意外或心肌病、严重心律失常、严重心力衰竭、严重的心脏瓣膜疾病、急性心肌梗死等心血管疾病患者和外周血管疾病或严重呼吸系统疾病、严重的肝及肾功能不全或甲状腺功能异常，存在嗜酒、睡眠倒错、服用抗生素、抗血小板药或调脂药的患者。本研究经过本院伦理委员会审核通过［审批号：2019-科研（073）号］，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方 法

1.2.1 资料收集 记录入组者的性别、年龄、身高、体质量、吸烟史、酗酒史、高血压病程，既往病史、过敏史、手术史及药物使用情况，第二天清晨07：00 在患者空腹状态下抽静脉血。送医院检测血常规、肝及肾功能、止凝血功能、糖化血红蛋白（hemoglobin A1C，HbA1c）、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）。同时每例患者留取外周静脉血标本3 mL 装于紫色盖头的装有枸橼酸钠的抗凝管。

1.2.2 动态血压检查 ABPM 仪器采用无创型携带动态血压检测仪（美国SunTech 医疗公司，Oscar 2 系列动态血压仪），设定自动充气测血压的时间间隔：白天（06：00-22：00）30 min，夜间（22：00-次日06：00）60 min。袖带缚于右上臂。检查时间为入院后第2天08：00-09：00到第3天同样的时间，总计为24 h，记录期间受试者生活规律照常，日常活动不受限制。检查完毕后用电脑分析软件自动分析，收缩压＞260 mmHg 或＜70 mmHg、舒张压＞150 mmHg或＜40 mmHg、脉压差＞150 mmHg 或＜20 mmHg 的血压值视为无效读数，予剔除。其中有效血压读数＞85%为合格；所有入组患者于抽血当天开始24 h动态血压检查，第2天完成检查，数据均储存在我院公共电子资料库，不合格者第2天开始重测。记录以下参数：24 h平均动脉压（24 hour mean arterial blood pressure，24 hMABP）、24 h 平均脉压差（24 hour mean pulse pressure，24 hMPP）、24 h 平均收缩压（24 hour mean systolic blood pressure，24 hMSBP）、24 h 平均舒张压（24 hour mean diastolic blood pressure，24 hMDBP）、白天平均收缩压（daytime mean systolic blood pressure，dMSBP）、白天平均舒张压（daytime mean diastolic blood pressure，dMDBP）、夜间平均收缩压（nighttime mean systolic blood pressure，nMSBP）、夜间平均舒张压（nighttime mean diastolic blood pressure，nMDBP）、夜间血压下降率（nighttime blood pressure decrease rate，NBPDR）=（白天血压平均值-夜间血压平均值）/白天血压平均值。

1.2.3 动态血压诊断高血压的标准和分级标准动态血压诊断高血压的标准：动态血压白天平均值≥135/85 mmHg，或24 h 平均值≥130/80 mmHg，或夜间平均值≥120/70 mmHg。以24 h 血压平均值标准进行分级：1 级高血压为130/80～145/90 mmHg；2 级高血压为145/90～160/100 mmHg；3 级高血压为＞160/100 mmHg。如果收缩压与舒张压出现不同结果，以高一级为最终分级［9，15］。

1.2.4 高血压患者昼夜节律模式分组标准 动态BPDR＝（白天平均血压－夜间平均血压）×100%/白天平均动脉血压。NBPDR 通常为10%～20%，高血压患者部分血压节律消失，即≤10%；NBPDR≤0%为反杓型，≥20%为超杓型，据我院既往数据统计，这两类患者所占数量太少，反杓型归入非杓型组，超杓型归入杓型组，据此我们将患者分为非杓型组（0%～10%，≤0%）、杓型组（10%～20%，≥20%）［9，15］。

1.2.5 血浆内皮微粒水平的检测（1）采集高血压患者3 mL 外周血液标本后，送检验科，4 h 内提取血小板贫瘠血浆：先于室温下1 500g离心10 min，获得富含血小板血浆，移1.5 mL 入EP 管中，然后13 000g，4 ℃，离心10 min，获得贫瘠血小板血浆，-20℃保存；（2）检测样本取出一次性冻融后，从样本中取50 μL，加入20 μL 特异性荧光抗体［异硫氰酸荧光素（FITC）抗人CD31（anti-CD31-FITC）和藻红蛋白（PE）抗人CD42b（anti-CD42b-PE）］。另取50 μL 加入同等数量的同型抗体（IgG1-FITC），室温下避光孵育30 min；（3）孵育30 min 后，各管加入1 mL 的鞘液后上流式细胞仪（Beckman Coulter epics XL，单激光四色，美国）测定：采用1.0 μm 的乳胶微球设门，EMP 定义为≤1.0 μm 且CD31+/CD42b-，根据绝对计数微球的浓度换算得出血浆中EMP 的水平［4］，见图1。

图1 流式细胞仪检测结果［本图为1例重度高血压患者的流式细胞仪检测结果。A 图：利用1 μm 的标准微球设门，前向角散射对数（forward scatter logarithm，FSLOG）一般代表细胞的体积，数值越大代表细胞越大；侧向角散射对数（side scatter logarithm，SSLOG）一般代表细胞的颗粒度，数值越大代表细胞的颗粒度越大，CAL 门内的微粒直径大小即为≤1 μm；B 图：利用荧光抗体，根据anti-CD31-FITC 和anti-CD42b-PE 呈现的双参数图，图中所示的F 区域（CD31+/CD42b-区）即为要测量的血浆EMP 的水平］

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计学软件包对数据进行统计学分析。正态分布计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析；非正态分布计量资料以［M（P25～P75）］表示，采用非参数检验。定性资料用［n（%）］表示，组间比较采用卡方（χ2）检验。不同微粒之间的相关性分析采用Spearman相关性分析，不同微粒水平与临床参数的相关性及回归分析采用多元性相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的基本临床资料

研究期间，通过多方动员，符合本研究入组标准的高血压患者均来汕头市中心医院高血压门诊就诊，高血压门诊专职护士取得患者知情同意并入组。本研究共纳入患者共232例，其中有24例诊室血压初步诊断为高血压，动态血压检查排除了高血压，因留存有血液标本，故列出来作为白大衣高血压组。余符合动态高血压诊断标准的高血压未治患者共208例，其中男97例（46.6%），女111例（53.4%）（女性中：绝经前28例、绝经后83例）；吸烟76例（36.5%），无吸烟132例（63.4%）；年龄（56.0±10.9）岁，年龄最小31岁，最大75岁。按动态血压分级标准：高血压1 级101例，2 级45例，3 级62例。一般资料中4 组患者除年龄、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）外，其余指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；4 组患者动态血压参数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；白大衣性高血压及高血压1、2、3 级组患者一般资料及动态血压参数比较，详见表1。

存在统计学差异的各项目中，再进一步用Tukey HSD事后多重比较法进行两两比较：1 级组患者年龄高于其余各组，3 级组患者LDL-C 浓度低于1 级组或2 级组，差异有统计意义（P＜0.05）；白大衣高血压组患者与1 级组患者的24 h MDBP、dMDBP、nMDBP比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 级组患者NBPDR 低于白大衣高血压组或1 级组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 不同高血压级别组患者一般情况及动态血压参数的比较 ［n（%），，M（P25～P75）］

表1 不同高血压级别组患者一般情况及动态血压参数的比较 ［n（%），，M（P25～P75）］

注：存在差异各项目中进行Tukey HSD 事后多重比较，①表示该组与其他各组均存在统计学差异，余两两比较不存在统计学差异；②表示该组与1、2 级高血压组进行比较存在统计学差异，余两两比较不存在统计学差异；③表示各组中两两比较均存在统计学差异；④表示该组与白大衣高血压组比较不存在统计学差异，余两两比较均存在统计学差异；⑤表示该组与白大衣、1 级高血压组比较存在统计学差异，余两两比较不存在统计学差异

2.2 不同高血压分级标准患者的内皮微粒水平比较

以动态血压作为高血压的分级标准的4 组患者的EMP 水平比较：3 级高血压组患者的EMP 水平高于白大衣高血压、1 级高血压、2 级高血压组患者，差异有统计学意义（均P＜0.05）；以诊室血压作为高血压的分级标准的3 组患者的EMP 水平比较：3 级高血压组EMP 水平高于1 级高血压、2 级高血压组，差异有统计学意义（均P＜0.05），详见表2。

表2 不同高血压分级标准患者的EMP水平比较 ［］

表2 不同高血压分级标准患者的EMP水平比较 ［］

注：存在差异各项目中进行Tukey HSD 事后多重比较法，①表示该组与其他各组均存在统计学差异，2 级高血压组与白大衣高血压组进行比较存在统计学差异，余各组两两比较不存在统计学差异；②表示1 级高血压组与余两组两两比较均存在统计学差异，余两组比较中不存在统计学差异

2.3 不同血压昼夜节律模式分组高血压患者的临床资料及内皮微粒水平比较

高血压患者中，动态血压非杓型组患者的年龄、体质量指数、HbA1c、24 hMPP、nMSBP、nMDBP、EMP 水平高于杓型组；LDL-C、诊室舒张压、白天舒张压、NBPDR 低于杓型组，差异有统计学意义，见表3。

表3 杓型组与非杓型组高血压患者的临床资料及EMP 比较 ［n（%），］

表3 杓型组与非杓型组高血压患者的临床资料及EMP 比较 ［n（%），］

2.4 不同高血压分级、不同血压昼夜模式患者内皮微粒水平比较

不同分级高血压患者的EMP 水平在血压杓型组与非杓型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 不同级别高血压患者血压杓型组与非杓型组的EMP 水平的比较 ［］

表4 不同级别高血压患者血压杓型组与非杓型组的EMP 水平的比较 ［］

2.5 相关性和多元性回归分析结果

相关性分析结果显示，高血压患者NBPDR与EMP 水平（个/μL）均存在负相关性（r=-0.682，P＜0.001）。在多元线性回归的的模型建立中，EMP为因变量，性别、年龄、体质量指数、三酰甘油、LDL-C、HbA1c、CRP、尿酸、HCY、诊室收缩压、诊室舒张压、24 hMABP、24 hMPP、24 hMSBP、24 hMDBP、dMSBP、dMDBP、nMSBP、nMDBP、NBPDR为自变量。利用逐步回归法，定义引入自变量的P值为0.10，剔除自变量的P值为0.11，标准化后的EMP 的多元线性回归方程：EMP=0.336nMSBP+0.217nMDBP-0.437NBPDR，说明NBPDR 对高血压患者EMP 水平的存在预测价值，见表5。

表5 高血压患者EMP 水平影响因素的多因素分析结果［n=208］

3 讨论

在有关动脉硬化和血管内皮细胞调亡的研究中，血流中的微环境一直是国内外的研究热点，血流中除了血细胞、血小板，不可否认还有很多直径在微米级别或纳米级别的各种微粒，它们在血管硬化、肿瘤的转移等疾病的发病过程所发挥的作用，一直是国内外研究的重点。在本研究中，入组的诊室高血压患者，如果以诊室血压进行分级标准，发现2 或3 级高血压患者EMP 水平较1 级高血压患者升高，而2 和3 级高血压患者不存在统计学差异，Preston 等［16］、Bernal-Mizrachi 等［17］就报道了严重的高血压在血流中产生的切应力会加速EMP的释放，而后者又加速了动脉粥样硬化，具体机制有待进一步研究，结果与本研究相同，但其高血压分级以诊室血压作为分级标准，本研究以动态血压的24 h 平均动脉血压作为分级标准，与之相比，本研究在高血压分级方面更能全面反映患者的真实血压平均水平。本研究的3 级高血压患者比例增加，并利用动态血压排除了“白大衣效应”的诊室血压升高患者，更精确地以动态血压作为不同的分级，发现EMP 水平在3 级高血压患者中升高，血循环EMP 水平与血压水平呈正相关。在EMP与动脉硬化方面，有研究报道EMP 介导了内皮细胞的炎症反应，加速了内皮功能障碍、动脉硬化的发生［18］，从而指出了微粒在高血压中具有重要的潜在价值，是可以通过监测内皮功能来反映高血压病程的崭新指标。国内研究表明高血压患者中，血EMP（CD31+/CD42b-）水平与动脉弹性存正相关性，EMP 是动脉弹性的独立影响因素［19］，另有研究也证实EMP与反映动脉硬化的相应指标存在正相关性［20］，这些研究均提示EMP 可作为反映高血压患者动脉硬化程度的血液学指标；是进一步研究高血压作为慢病防治的新的切入点，且具有预后判断价值。高血压患者血压升高，也提示了其动脉正以更快的速度发生粥样硬化，靶器官的损害正要或正在发生，此时必须进行加强血压的控制。在中重度高血压患者中，应重视动态血压的监测，更精确评估患者的血压水平，并选用钙通道阻滞药（CCB）类或血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ACEI/ARB）类等对血管内皮有保护作用的药物，在降压同时能防治动脉硬化及保护靶器官损害的进一步加重。

高血压患者BPCR 是其发生心脑血管事件的独立预测因子，这种血压的正常生理的昼夜模式，对维持血管及保护心、脑、肾等重要器官的正常结构和功能具有非常重要的意义，如果这种生理血压节律消失，存在夜间高血压，这就会在夜间血压对血管的侧压强异常增加，损伤血管，引发或加重动脉粥样硬化，且会造成心、脑、肾等重要器官在夜间仍处于超负荷运转中，最终首先导致了这些靶器官的损害，严重时导致严重的急性并发症［21］。血循环EMP 水平在动脉粥样硬化进程中发挥着关键作用，是近年来提出的反映动脉粥样硬化的血液指标。本研究发现在高血压患者中的EMP（CD31+/CD42b-）在杓型组与非杓型组之间存在差异，并且EMP（CD31+/CD42b-）水平在1、2、3 各级别的杓型组与非杓型组亚组患者中存在差异。相关性分析结果显示，NBPDR与EMP（CD31+/CD42b-）有良好的相关性。以EMP为因变量的多元线性回归分析显示，NBPDR 是高血压患者EMP 水平的独立预测因子，具有预侧价值。这与近年相关研究证实了正常高值血压的BPCR 消失对血管内皮功能的损害较节律正常者严重［22］，并有研究结果与本研究结果一致［5］。高血压导致动脉粥样硬化的进程，血压升高后血流中湍流的增多和切应力，损伤了血管内膜和血管壁，这时血管内皮细胞会分泌信号因子，部分有舒张血管以适应血管压力及减轻血管内壁的损伤，这时EMP 释放增多，同时内皮细胞受损后其再生或凋亡速度加快，CD31+的EMP 是内皮细胞凋亡的标志，与血管内皮损伤呈正相关。肿瘤坏死因子的分泌增多从另一方面促进了EMP 数量的增多，其一，EMP表面表达的E-选择素（E-selecting）、细胞间黏附分子（ICAM-1）等黏附分子，在动脉中层结构中介导免疫炎症反应；其二，EMP 能直接进入动脉中层结构，其表面的某些信号结构能激活血管平滑肌细胞，进而破坏血管弹性层，促进粥样斑块的形成，加速血管平滑肌细胞在内膜下的迁移和增殖，加快动脉粥样硬化的进程；其三，EMP 可以直接干扰内皮系统使其释放一氧化氮或前列环素等血管舒张因子分泌减少，同时使内皮素相对性增多［18，23-24］。已有研究证实血管内皮系统中血管内皮的功能、结构的损伤及炎症因子的释放参与了高血压患者动脉硬化的发生，是动脉粥样硬化重要的发病机制之一。另外，本研究发现不同血压昼夜模式中，年龄、体质量指数、HbA1c、24 hMPP 等在非杓型组患者中高于杓型组患者。这提示随着年龄增大、体质量增加、糖耐量异常可能使正常BPCR 消失发生率增加，另非杓型高血压患者脉压差增大，可能与动脉硬化程度加重相关，再一次强调控制夜间高血压的重要性。

然而，本研究的样本量偏少，受此限制也未能对吸烟者或绝经后女性是否存在EMP 水平的升高进行分析；本研究是用流式细胞技术检测EMP，虽为目前国内外最常用的方式，但无经过透射电子显微镜下的筛查排除掉直径相似其他血清中的碎片；受研究资金的限制，未进行其他多种表型的EMP 水平的检测而进行多重检验；本研究为横断面研究，无法明确高血压与血循环EMP 水平的因果关系，以及缺少非杓型高血压患者转为杓型血压后血循环EMP 水平的变化，及EMP 对高血压患者预后的影响。

综上所述，EMP 在高血压患者发生动脉硬化的发病机制处于关键环节，主要机制为直接损伤内皮，介导动脉中层弹性结构的免疫炎症反应，引起血管内皮系统功能障碍，最终导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。降压达标应包括保持正常的BPCR，因为夜间睡眠占了一天的1/3 时间以上，且这部分时间所发生的情况极易被医患双方忽视。且本研究也初步证实了夜间高血压患者血循环EMP 水平升高，如存在夜间高血压，其加重动脉硬化的作用不亚于白天高血压，因此，通过动态血压的检查筛查出非杓型高血压患者，根据其24 h 血压变化，更针对性地用药，恢复其正常的BPCR，做到更好、更全面地防治高血压，保护心、脑、肾等靶器官，甚至逆转已经存在的损害，而从血循环的EMP 入手，以更精准的免疫治疗作为方向可能是另一个突破口，高血压慢病防治工作的最终目标就是在血压控制达标后同时减慢动脉硬化的进展，防止靶器官损害，预防急性心脑血管事件的发生。