陈梦婷,董志国,张殷建
青光眼作为全球第二位致盲性眼病,若不加以治疗,最终可导致失明[1]。目前全球约有7,600 万青光眼患者,其中失明患者约为1,120 万[2],预计到2040年青光眼患者可能会增至1.118 亿[3],严重影响患者的生活质量。眼压升高是青光眼的主要危险因素。虽然眼压升高的机制还未完全清楚,但可以通过药物或手术降低眼压以减缓青光眼造成的视神经损害。目前,眼科学者一直对治疗青光眼新药进行研究,探寻眼压升高的机理以寻找新的治疗药物。另外,某些中药也具有降低眼压的作用,为青光眼的治疗提供了更多选择[4]。清肝利水方是上海市名老中医、眼科专家邹菊生的经验方,经多年临床应用,具有良好的疗效,课题组前期临床研究[5]证实本方在原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)患者视力、视野平均敏感度及全身症状改善方面均有很好的疗效,还有协同降低眼压的作用。为验证清肝利水方降低眼压的作用,采用SD 大鼠进行实验性眼压升高的造模,并进行相关的实验研究。
本实验选用6~8 周龄清洁级健康雄性SD 大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2017-0005)48 只,体重(150±30)g,所有大鼠毛发色泽光亮,眼外观、眼压均正常。饲养于复旦大学动物实验中心,在独立换气系统的笼具中,4 只/笼,温度维持在21℃左右,12 h 光/暗循环照明,常规饲料饲养,给予充足的水和活动空间。相关实验操作均符合动物伦理及动物中心相关管理办法。实验结束后腹腔注射25%乌拉坦(8 ml/kg)将大鼠处死。
水合氯醛(国药集团工业股份有限公司);乌拉坦(国药集团工业股份有限公司);0.4%盐酸奥布卡因滴眼液(日本参天制药有限公司,批号:JX20160077);复方托吡卡胺滴眼液(日本参天制药有限公司,批号:J20180051);氧氟沙星眼膏(沈阳兴齐制药有限公司,批号:H10940177);盐酸左布诺洛尔滴眼液(ALLERGAN 艾尔建有限公司,批号:H20130765);超顺磁性氧化铁磁珠(superparamagnetic iron oxide,SIO)(美 国Bangs Laboratories 公司);OPMI VISU 显微镜(德国蔡司公司);微量注射器(上海高鸽工贸有限公司);手持式数字眼压计(Tonopen XL)(美国Medtronic Solan 公司);一次性注射器(常州双马医疗器材有限公司);显微手术器械(苏州六六视觉科技公司)。
10%水合氯醛:取5 g 水合氯醛,加0.9%氯化钠溶液定容至50 ml,现用现配。25%乌拉坦:取25 g 乌拉坦,加0.9%氯化钠溶液定容至100 ml,现用现配。
清肝利水方药物组成为:夏枯草12 g、葛根15 g、车前子15 g、枸杞子12 g。本方生药购于上海中医药大学附属龙华医院中药房,由上海华宇药材有限公司提供,均为道地药材,由上海中医药大学生药研究教研室专职员工进行药材评估。
制备方法:加入7 倍生药重量的水沸腾煎煮2次后,将所有水煎剂混合并蒸发浓缩至最终浓度为1 g/ml。将制备好的中药储存于-20℃备用。使用时按所需浓度加入大鼠饮用水中稀释,注意所有大鼠灌胃同等体积中药溶液,2 ml/d。
1.4.1 造模 所有大鼠适应性饲养3 d 后进行造模。通过眼前房注射SIO 术建立稳定的慢性高眼压大鼠模型,参考Paulina A[6]、Chen YQ[7]、Zhang C[8]的方法对大鼠左眼进行造模。
具体操作方法如下:先将大鼠称重,用10%水合氯醛溶液进行腹腔注射麻醉,剂量为4 ml/kg,待其无意识后使其身体侧卧,暴露左眼于OPMI VISU显微镜下;0.4%盐酸奥布卡因滴眼液眼表局部麻醉,待术眼角膜反射消失后使用复方托吡卡胺滴眼液进行扩瞳,以减少手术引起的虹膜损伤。先用1 ml一次性无菌注射器针头在角巩膜缘刺一小口,以便微量注射器进入。用振荡器将SIO 振荡混匀后,用25 μl 微量注射器吸取10 μl SIO 并从角巩膜缘小口小心穿刺进入前房角后缓慢注入SIO,注射后以小型手持磁铁(0.45 T)将SIO 吸引至穿刺口另一端后再拔出注射针,以防SIO 经穿刺口外流,再用磁铁将SIO 均匀分布于眼前房以阻塞小梁网升高眼压。空白组进行假手术,用0.9%氯化钠溶液替代SIO,以消除手术操作的影响。术后眼表予氧氟沙星眼膏覆盖,预防感染。观察30 min 左右,待大鼠麻醉完全苏醒后再将其送回饲养室。术后1 周眼压值持续升高,且与造模前眼压差异均具有统计学意义(P<0.05)[9],提示造模成功。
1.4.2 分组与处理 将SD 大鼠随机分为6 组,空白组、模型组、中药低浓度组(LCG)、中药中浓度组(MCG)、中药高浓度组(HCG)、阳性对照组(PG),每组8 只。中药低、中、高浓度组予清肝利水方灌胃,浓度分别为3.1 g/kg、6.2 g/kg、12.4 g/kg(按人与动物之间体表面积关系换算得出该水煎剂的正常给药量为6.2 g/kg,低、高浓度组给药量为正常给药量的1/2 和2 倍[10]),空白组、模型组、阳性对照组给予饮用水灌胃,各组剂量相同,每日1 次。除灌胃外,阳性对照组大鼠每日予盐酸左布诺洛尔滴眼液,其余各组予0.9%氯化钠溶液滴眼,滴左眼,每日1 次。
于造模前及造模后1、3、7、14 d 测量左眼眼压值,为减小误差,每次于同一时间段(13:00-15:00)进行测量,测量时按造模方法将大鼠全麻和局麻,使用手持式数字眼压计进行连续5 次测量,取数值偏差小于5%的平均值作为眼压值[7]。
使用SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差()表示,运用单因素方差分析(ANOVA)进行多组间比较,运用LSD-t 检验进行两两比较,当P<0.05 时,认为差异具有统计学意义。
剔除造模失败及后续产生眼底出血、白内障等并发症的大鼠,各组入组大鼠:空白组8 只、模型组6 只、中药低浓度组7 只、中药中浓度组7 只、中药高浓度组6 只、阳性对照组6 只。
空白组假手术后均稳定在10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)左右。其余各组注射SIO 后第1 d 起眼压均有升高,其中模型组持续升高。用药后,中药中浓度组、阳性对照组眼压下降最快,第7 d 开始持续下降,直至第14 d,阳性对照组眼压最低。
造模后,模型组眼压均高于空白组(t1d=22.259,t3d=19.065,t7d=10.545,t14d=11.204,均P=0.000)。造模后7 d,中药中浓度组眼压低于中药低、高浓度组,差异均有统计学意义(tLCG=58.106,tHCG=30.370,P=0.000)。各治疗组与模型组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);阳性对照组与中药各浓度组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。造模后14 d,各治疗组眼压均低于模型组(tLCG=20.981,tMCG=14.570,tHCG=18.737,tPG=11.539,均P=0.000);与阳性对照组相比,中药各浓度组眼压均升高,差异均有统计学意义(tLCG=6.671,tMCG=6.570,tHCG=5.279,均P=0.000)。中药各浓度组间眼压差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
表1 各组左眼在不同时间点的眼压值(,mm Hg)
表1 各组左眼在不同时间点的眼压值(,mm Hg)
注:# 与空白组比较,P<0.05;* 与模型组比较,P<0.05;&与阳性对照组比较,P<0.05;a 与低浓度组比较,P<0.05;b 与高浓度组比较,P<0.05
青光眼以病理性眼压增高为主要特征,随着病情进展,视力逐渐下降并伴有视野缺损,最终导致失明[1]。高眼压压迫视神经纤维和巩膜,可导致视神经轴突萎缩,轴浆流受阻,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)的营养供应不足,进一步引发视神经纤维的病变。并且高眼压可通过激活线粒体凋亡信号通路以及阻碍神经营养因子受体复合物的逆运输等引起视网膜神经节细胞的凋亡[11]。
本次慢性高眼压动物模型,沿用课题组前期的造模方法[8],采用SIO 眼前房注射以阻塞小梁网达到眼压升高的效果。经前期实践这种造模方法操作相对简便、成功率高,且升高眼压效果可维持4 周以上。本次实验SIO 注射量为10 μl,造模后眼压增高明显,说明此注射量有利于高眼压大鼠模型的更快建立。
临床上治疗青光眼以降眼压为主,可以有效控制一部分青光眼患者视野缺失,减缓视神经萎缩以及缓解眼部不适症状,但降眼压眼药水带来的诸如眼干涩、结膜充血等副作用明显,并且部分患者在降眼压治疗处理后仍无法阻止视野及视盘损害[1,11]。中医药在慢性青光眼的治疗中有一定优势,越来越受到重视。清肝利水方是名老中医邹菊生教授治疗青光眼的临床经验方,邹老认为本病病位在肝,病机是情志不畅致肝失疏泄,日久肝郁气滞而化火,肝火上扰于目,致使目中脉络阻滞,玄府郁闭,神水滞留,运行不畅而导致眼胀、视物膜糊,久则损害目系[12],故创立本方,方中夏枯草、葛根清肝泻火为君药,车前子利水为臣药,枸杞子补肝肾明目为佐药,全方共筑清肝利水明目之效。课题组在临床研究[5]中,观察到针对肝郁气滞型POAG 患者,试验组采用清肝利水方联合降眼压滴眼液,对照组只使用降眼压滴眼液,治疗后试验组总有效率高于对照组,且在视力、平均敏感度及全身症状改善方面均优于单纯西药组,证实清肝利水方可改善青光眼患者临床症状,提高生活质量。
本研究造模成功并经清肝利水方干预后,中浓度组、阳性对照组眼压下降最快,第7 d 开始持续下降,直至第14 d,阳性对照组眼压最低,且各浓度组较模型组明显下降。通过实验发现中药降眼压效果与浓度有关,推测低浓度组由于中药浓度过低,在短时间给药后药效不够阻止眼压的进一步升高,因此降眼压效果较差;高浓度组在造模后早期有较好的降眼压效果,而后期效果不如中浓度组,推测清肝利水方的降眼压效果与给药浓度并非完全呈正相关,而是达到一定给药浓度才能发挥较好的降眼压效果;中浓度组为计算后的标准给药剂量,在给药第7 d相对低、高浓度组降眼压效果更优。
现代药理学已验证了清肝利水方中的几味中药治疗眼病的药理作用。例如葛根的提取物葛根素是异黄酮化合物,已广泛应用于青光眼的临床治疗[13],夏枯草以及夏枯草醇提物可以抑制眼内一氧化氮(NO)的含量抑制眼病中的炎症反应和疼痛[14],车前子可以抑制过量的过氧化氢(H2O2)生成引起的晶状体上皮细胞的凋亡,具有抗氧化的能力[15]。枸杞子在高眼压动物模型中已验证对RGC 具有保护作用,其疗效可能与结晶蛋白的上调有关[16]。清肝利水方降低眼压的作用可能涉及血管、轴突病变、免疫、氧化应激、自噬、细胞因子等多种机制,是清肝利水方中的哪些有效成分发挥主要作用,以及具体作用机理及机制将是进一步研究的方向。