雷公藤多苷下调miR-146a表达以改善类风湿关节炎患者Th17和Treg细胞数目失衡的机制研究

马衍慧 章建峰 刘丽敏

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是自身免疫系统错乱引起的高发病率、致残率的自身免疫性疾病[1～3]。RA 有慢性进展性多关节滑膜炎，软骨、股关节破坏等症状[4，5]；严重者累及多器官多系统。但病因、发病机制尚不明确，所以早期治疗与预防是重点研究方向。miRNAs 与RA 密切相关，miR-146a 是潜在治疗靶点。雷公藤辅助治疗RA 十多年，雷公藤多苷作为雷公藤提取物也对风湿关节炎有抑制效果[6～8]。本次研究旨在探索雷公藤多苷下调miR-146a 表达以改善RA 患者Th17、Treg 的影响及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2017 年10 月至2020 年10 月在浙江中医药大学附属湖州中医院首次被诊断并治疗的RA 患者，纳入标准为：①患者符合2010 年的EULAR 分类标准；②疾病活动性评分28 评分≤5.1 分。排除标准为：①心、肺、肾功能严重不全；②合并有其他自身免疫疾病；③合并有其他关节炎或结缔组织疾病。共纳入RA 患者60例，其中男性21例、女性39例；平均年龄为（44.43±1.51）岁，平均病程为（38.03±0.69）个月。随机分为两组，其中雷公藤组男性11例、女性19例；平均年龄为（44.45±1.52）岁，平均病程为（38.03±0.69）月。安慰剂组男性10例、女性20例；平均年龄为（44.21±1.34）岁，平均病程为（38.04±0.67）个月。两组间性别、年龄、病程比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。选择同期来院体检的健康志愿者作为对照组，其中男性20例、女性40例；平均年龄为（45.91±1.42）岁。对照组与RA 患者之间性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。所有研究对象均知情同意，本次研究经本院伦理委员会审核批准。

1.2 方法 在常规西药治疗的基础上，雷公藤组给予雷公藤多苷片（由湖南协力药业有限公司生产）1 mg/kg，每天3 次，饭后服用。安慰剂组服用与雷公藤多苷片形状气味相近的淀粉制品，服用时间与雷公藤组相同，服用量与雷公藤多苷片相同。两组服用时间均为6 周。

1.3 检测指标

1.3.1 外周血中miR-146a 表达水平 采用抗凝真空管分别采集RA 患者服药前与服药6 周后，及对照组健康体检时的肘正中静脉血5 ml，按照密度梯度离心法分离外周血单核细胞，吸出离心管内中层絮状物质。使用1 ml TRlzol 试剂提取总RNA，之后按照qPCR 试剂盒说明书逆转录cDNA，以95 ℃下15 s，60 ℃下45 s对反应物进行扩增。将U6作为细胞内参，miR-146a 的表达水平采用2-ΔΔCt方法计算。详细引物序列见表1。

表1 qPCR详细引物序列

1.3.2 外周血中Th17、Treg 细胞含量 采用抗凝真空管分别采集RA 患者服药前与服药6 周后及对照组健康体检时的清晨空腹时肘正中静脉血5 ml。在各个流式管中分别加入CD4-PC5 与CD25-PC5，以4 ℃的环境孵育30 min。加入固定破膜液100 μl 后避光保存30 min，使用Wash Buffer 重悬后继续加入胞内标记抗体IL-17A-PE 与FOXP3-PE，遮光保存30 min后上机检测Th17、Treg细胞含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，计量资料组间比较采用t检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA 组与对照组的miR-146a、Th17 细胞构成比、Treg细胞构成比比较见表2

表2 RA组与对照组的miR-146a、Th17细胞构成比、Treg细胞构成比比较

由表2 可见，RA 组患者miR-146a、Th17 细胞构成比高于对照组，而Treg 细胞构成比则低于对照组，差异均有统计学意义（t分别=13.62、26.39、29.93，P均＜0.05）。

2.2 雷公藤组和安慰剂组服药前后miR-146a、Th17细胞构成比、Treg细胞构成比比较见表3

表3 雷公藤组和安慰剂组服药前后miR-146a、Th17细胞构成比、Treg细胞构成比比较

由表3 可见，雷公藤组服药6 周后，miR-146a、Th17 细胞构成比较服药前有所下降，Treg 细胞构成比较服药前有所上升，差异均有统计学意义（t分别=6.77、37.74、13.48，P＜0.05）。安慰剂组服药6 周后的改变幅度并不明显，差异均无统计学意义（t分别=1.12、0.12、0.03，P均＞0.05）。

2.3 雷公藤组服药6 周后与对照组miR-146a、Th17 细胞构成比、Treg 细胞构成比比较见表4

表4 雷公藤组服药6周后与对照组miR-146a、Th17细胞构成比、Treg细胞构成比比较

由表4 可见，雷公藤组服药6 周后，miR-146a、Th17 细胞构成与对照组比较，差异均无统计学意义（t分别=0.91、0.39，P均＞0.05），Treg 细胞构成低于对照组，差异有统计学意义（t=2.34，P＜0.05）。

3 讨论

RA 是一种数十年发病率逐渐增高的慢性自身免疫性疾病，以广泛性、发展性的关节滑膜炎为主要临床特征。RA炎症效应持续刺激关节滑膜增生，促进血管翳增长，从而使得关节腔发生不可逆的收缩，从而侵犯关节软骨与关节囊及其附属韧带，最终使得关节发生畸形并损失一定运动能力，进而造成骨损伤与骨破坏[9，10]。临床上RA往往不止影响相关关节，患者常常出现皮肤、心脏、肾脏、肝脏、血液等器官组织的累及。虽然RA 的病情进展较为缓慢，但是病症对于日常生活影响较大，因此，针对RA的早期检测指标与早期治疗方案极为重要。

近年来多项研究指出CD4+T 细胞亚群如Th1、Th2、Th17、Treg 等在RA 的发生发展过程中起到了不可或缺的作用[11，12]。Th17细胞与Treg 细胞分别调控着炎症的产生与缓解，两种细胞互相拮抗从而维持机体内部不发生自身免疫性疾病[13]。较多学者认为相较于健康人群，多数RA 患者外周血中常见Th17 细胞构成比增高而Treg 细胞构成比下降，从而进一步加速RA的发展过程[14]。

随着近年来高通量测序技术的飞速发展，细胞内部的非编码RNA 引起了众多关注，其中一类由数十个核苷酸组成的RNA 被称作为miRNA[15]。许多常见疾病被认为与机体内部细胞表达过多或过少miRNA 有关，并且有许多研究证实miRNA 能够对机体内部众多生理生化活动进行调节。张英等[16]研究表明，miR-146a 与RA 的发展过程密切相关，提取RA 患者外周的血单个核细胞，监测分析发现其miR-146a 的表达水平明显高于健康人群，但这其中的具体信号通路尚未得证实。雷公藤作为多年来治疗风湿类疾病的常见中药材，已有多项临床研究表明雷公藤具有一定抑制炎症反应、减少血管生成、改善机体免疫的效果。近几年来，研究人员将雷公藤提取物如雷公藤多苷、雷公藤甲素等作为研究的新方向和热点，廖大忠等[17]证实了其提取物具有一定抑制恶性肿瘤细胞增殖、降低某些miRNA 表达的作用。对于雷公藤具体通过何种途径对RA 炎症反应进行抑制尚未得到证实。

本次研究结果显示，RA 患者的miR-146a、Th17细胞构成比明显高于健康人群，Treg 细胞构成比低于健康人群（P均＜0.05）。并且本次研究结果还发现经过服用雷公藤多苷片后，雷公藤组的RA 患者miR-146a 表达水平、Th17 细胞构成比较服用前有明显下降，Treg 细胞构成比明显升高（P均＜0.05）。但安慰剂组的RA 患者三个指标水平均没有明显波动（P均＞0.05），说明雷公藤的疗效要比安慰剂更显著。并且雷公藤组服药6 周后miR-146a 表达水平、Th17 细胞构成比、Treg 细胞构成比与健康人群差距缩小，从而证实雷公藤多苷在临床上可以用于改善RA 患者的Th17、Treg 细胞数量失衡，进而缓解RA病情持续加重。miR-146a 表达水平的上升，将引起Th17 细胞构成比升高，并且Treg 细胞构成比下降，但其中的信号通路本次研究尚未探索。同时本次研究也存在一定的局限性，miR-146a 与Th17、Treg细胞的信号通路尚未探索证实。

综上所述，雷公藤多苷能够通过下调外周血中miR-146a 表达水平，从而增加Treg 细胞构成比，减少Th17 细胞构成比，进而缓解RA 患者的病情，为RA的早期治疗与检测提供了较大的可能性。