二甲四氯植物内生降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

封国君 杜良伟 龙迪 曾东强 王彦辉

摘要：【目的】筛选可降解二甲四氯除草剂的内生真菌，研究内生真菌对二甲四氯的降解特性和途径，为除草剂污染的微生物治理提供理论依据。【方法】采用平板培养法从被二甲四氯严重污染的飞机草中筛选可降解二甲四氯除草剂的内生真菌;采用形态学方法观察内生真菌在培养基上的形态，结合分子生物学方法对内生真菌的ITS、TUB和LUS序列进行克隆和测序，对内生真菌进行鉴定;通过单因素法优化内生真菌在无机盐培养基中对二甲四氯的降解条件（温度、pH和营养源）;并采用液相色谱标准品比对、气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）和液相色谱—质谱联用仪（LC-MS）鉴定内生真菌在无机盐培养基中降解二甲四氯的产物。在30 ℃恒温培养箱中，分别添加内生真菌到不灭菌土壤和灭菌土壤中，同时设不添加内生真菌的土壤为对照组，测定二甲四氯在土壤中的降解速率。【结果】从飞机草中初筛发现1株内生真菌可很好地降解二甲四氯，编号为E68，结合形态学和基因序列分析可将E68鉴定为树状炭角菌（Xylaria arbuscula）。在二甲四氯初始濃度为50.0 mg/L条件下，E68降解二甲四氯的最优条件是pH 5.0、温度28 ℃和添加0.5%的葡萄糖，7 d后其降解率为97.03%。E68在无机盐培养基中降解二甲四氯的主要产物为4-氯-2-甲基苯。在含有2.5 mg/kg二甲四氯的土壤中添加E68，可明显提高二甲四氯在土壤中的降解率;与不添加E68的土壤相比，在不灭菌和灭菌土壤中分别接入E68后，二甲四氯的降解半衰期分别提高2.8和2.5倍 。【结论】从飞机草中分离出的内生真菌E68在无机盐培养基和土壤中可有效降解二甲四氯，具有修复环境中二甲四氯污染的应用潜力。

关键词： 二甲四氯;生物降解;内生真菌;树状炭角菌;降解特性

中图分类号： S482.41                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1263-10

Abstract：【Objective】This experiment aimed to screen and identify 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid （MCPA）-degrading endophytic fungi from plants and studied the degradation characteristics and pathway of the isolated endophytic fungi to MCPA. The study provided atheoretical basis for the bioremediation of herbicide-contaminated environment. 【Method】Used plating method， endophytic fungus for degradation of MCPA were isolated from MCPA-contaminated Eupatorium odoratum. The isolated endophytic fungus was identified through morphological feature observed on the medium， combined with molecular biology method， cloning and sequencing of ITS， TUB and LUS sequences were conducted. The degradation conditions including temperature， pH， nutrition source were also optimized in the mineral salt medium by single-factor test.  The degradation product of MPCA by endophytic fungi was identified in the mineral salt medium using high performance liquid chromatography（HPLC）， gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS）.  In constant temperature incubator（30 ℃）， endophytic fungi were added into non-sterile soil and sterile soil， and soil adding no endophytic fungi was as control group， and degradation rate of MCPA in soil were detected. 【Result】An endophytic fungus strain （numbered E68）， screened from E. odoratum， could effectively degrade MCPA.The E68 was identified as Xylaria arbuscula according to the analysis of its phenotypic feature and gene sequence. When the initial concentration of MCPA was 50.0 mg/L， the optimum degradation condition of MCPA was pH 5.0， temperature 28 °C and adding 0.5% glucose，the degradation rate was 97.03% after 7 d. The main production of strain E68 degrading MCPA was 4-chloro-2-methylphenol. Adding E68 into soil with 2.5 mg/kg MCPA could increase the degradation rate of MCPA in soil. Compared with soil without E68， the half-lives of MCPA increased 2.8 times in non-sterilized soil adding strain E68 and increased 2.5 times in sterilized soil adding strain E68. 【Conclusion】The endophytic fungus E68 isolated from E. odoratum can effectively degrade MCPA in inorganic salt media and soils， and has potential value for the bioremediation of MCPA-contaminated environment.

Key words： 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid; biodegradation; endophytic fungus; Xylaria arbuscula; degradation characteristics

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201100）; National Natural Science Foundation of China（31660524）; Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198140）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2018YM23）

0 引言

【研究意義】二甲四氯（2-甲基-4-氯苯氧乙酸） 是苯氧羧酸类除草剂的一种，是广西甘蔗生产使用最多的一种激素类除草剂，主要用于防控阔叶杂草和莎草等。二甲四氯主要加工成盐制剂使用，其在水中的溶解度高，易随着雨水淋溶而污染地下水（Matamoros et al.，2012;Loos et al.，2017）。研究证实，二甲四氯在土壤中残留期相对较长，尤其在酸性土壤中残留期更长（López-Pi?eiro et al.，2013），对生态环境有潜在风险。广西蔗田主要为酸性土壤，且间套种多种作物，二甲四氯易对间套种作物和后茬敏感作物产生药害。微生物降解是二甲四氯在土壤环境中最主要的降解方式之一。近年来，研究发现植物内生菌与植物互惠共生，对去除环境中农药等有机污染物及生态系统修复具有显著效果（冯发运等，2015;Tétard-Jones and Edwards，2015;Trognitz et al.，2016）。因此，筛选具有降解二甲四氯能力的植物内生菌并对其降解特性进行研究，对修复受二甲四氯污染的土壤和水体具有重要意义。【前人研究进展】物理和化学方法是去除土壤和水体有机物污染的高效手段（Chair et al.，2017a，2017b），但对农业来说成本较高。自然环境中微生物资源丰富，存在大量可有效降解有机物的微生物（Ellegaard-Jensen et al.，2017;Sam et al.，2017）。研究发现土壤或淤泥中存在多种可降解苯氧羧酸类除草剂的细菌，Wu等（2017）分离出的Cupriavidus gilardii T-1可快速降解苯氧羧酸类除草剂2，4-D、2，4-D丁酯、二甲四氯和二甲四氯丁酯等，但对二甲四氯丁酯的降解效率远低于二甲四氯;Xia等（2017）分离出的无色杆菌（Achromobacter sp.）可降解2，4-D最终生成3-氧代己二酸二乙酯，进入TCA循环，还可降解二甲四氯。细菌降解苯氧羧酸类除草剂2，4-D的机制研究已较清楚，主要涉及tfd基因编码的酶催化2，4-D（Wu et al.，2017;Xia et al.，2017）。目前已分离出可降解2，4-D和二甲四氯除草剂的多种细菌，同时对2，4-D的降解机制研究较深入，但针对二甲四氯降解机制的研究较少。内生菌是一种重要的微生物资源，既可有效降解有机物，又能与植物联合进行生态修复，还可促进植物生长等（傅婉秋等，2017;陶佳雨等，2019）。Liu等（2014）从烟草中分离出1株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），其对二氯喹啉酸的降解率高达93%;冯发运等（2015）从小飞蓬中分离出的阪崎克罗诺杆菌属（Cronobacter sp.）可高效降解毒死蜱，尤其是添加外源营养源可明显提高其对毒死蜱的降解率;Xie和Dai（2015a，2015b）、Xie等（2016）分离出的2株内生真菌拟茎点霉（Phomopsis sp.）可降解阿魏酸、肉桂酸和芥子酸等有机物，并对其降解机制进行深入研究;Wang等（2017）从甘蔗中分离出的间型脉孢菌（Neurospora intermedia）可有效降解敌草隆，鉴定代谢产物证明该菌通过连续脱烷基方式降解敌草隆。目前，降解二甲四氯的真菌，尤其是植物内生真菌鲜有报道，对其降解二甲四氯的机制或途径尚不清楚。【本研究切入点】前人主要从污染的土壤和水体中分离二甲四氯降解菌，对植物内生真菌降解二甲四氯的研究较少，对二甲四氯的降解途径和微生物修复土壤中二甲四氯污染的研究也鲜见报道。【拟解决的关键问题】从被二甲四氯严重污染的植物中分离对二甲四氯有降解效果的内生真菌，采用形态学和分子生物学方法进行鉴定;采用单因素法优化内生菌降解二甲四氯的条件;运用高效液相色谱（HPLC）、液相色谱—质谱联用仪（LC-MS）和气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）等手段鉴定降解产物;在室内可控条件下，将分离获得的内生菌接种到土壤中进行土壤修复研究，以期为微生物治理除草剂残留污染提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试植物：飞机草，来源于生产二甲四氯的农药厂及其附近。供试除草剂：98.0%二甲四氯钠原药（广西田园生化股份有限公司提供）。主要试剂：胰蛋白胨和酵母提取物（英国Oxoid公司）;马铃薯葡萄糖琼脂培养基，真菌DNA提取试剂盒（Omega Biotek公司）;Taq PCR StarMax试剂（北京康润诚业生物科技有限公司）;其余试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：安捷伦高效液相色谱仪（HPLC）（美国安捷伦科技有限公司）;光学显微镜（日本尼康公司）;超净工作台（苏州净化设备有限公司）;培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;恒温振荡摇床（常州翔天实验仪器厂）;高速离心机（德国HERMLE公司）;PCR仪（杭州柏恒科技有限公司）等。

无机盐液体培养基（MM）：K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，NH4NO3 1.00 g，NaCl 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水1000.0 mL，pH 7.0;无机盐固体培养基（MMA）：MM培养基中加15.00 g琼脂粉。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 内生降解菌分离 参照Khan等（2014）的平板培养法分离内生菌并略有改进。选取健康的植物组织，在超净工作台中用剪刀剪成约2 cm长，以75.0%酒精浸泡消毒2 min，再用2.0%次氯酸浸泡2 min，无菌水反复冲洗3～5次，在灭菌研钵中快速将组织磨碎，取100 μL磨碎的样品溶液涂布于含二甲四氯的MMA培养基表面，28 ℃下培养7 d。用最后一次洗脱的无菌水涂布于LB和PDA培养基上，验证表面灭菌效果。

在MMA培养基上挑取不同形态的真菌，在含二甲四氯的PDA培养基上进行分离纯化，直至菌落单一后进行编号保存，以备后续进行鉴定和验证降解效果。

1. 2. 2 二甲四氯降解菌鉴定 形态学鉴定：将纯化好的内生真菌接种到PDA培养基上，于28 ℃恒温培养箱中培养，定期观察其形态，以尺子测量其直径，采用不同方式诱导并观察其产生孢子情况。

分子生物学鉴定：按照DNA抽提试剂盒说明提取真菌总DNA。采用3对引物[委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成]对内生真菌的ITS、TUB和LSU进行PCR扩增，引物信息见表1。PCR反应体系20.0 μL：2×PCR StarMix 10.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。按照表1文献条件进行PCR扩增。测序结果与GenBank已公布的核酸序列进行同源比对。

1. 2. 3 内生菌降解二甲四氯特性分析 单因素法优化降解条件：分别研究不同温度、pH和营养源对分离所得的内生真菌降解二甲四氯效果的影响。二甲四氯的起始浓度均为50.0 mg/L，当pH 7.0时分别设5个不同温度：20、25、30、35和40 ℃，测定内生菌在5个不同温度下对二甲四氯的降解效果，确定最佳温度;固定培养温度为30 ℃，分别采用1.0 mol/L HCl和NaOH调节无机盐培养基pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，研究pH对内生菌降解二甲四氯的影响;在温度为30 ℃、pH 7.0时，分别加入0.5%的淀粉、葡萄糖、蔗糖、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨等营养源，测定添加不同外源营养源时内生菌降解二甲四氯的效果。以二甲四氯在不添加内生菌无机盐培养基中的自然降解为空白对照。

1. 2. 4 降解产物鉴定 按照优化的降解条件进行降解产物检测与鉴定，分别在降解5、7和14 d进行取样，同时设空白对照，每个试验3次重复。代谢产物通过标准品比对，LC-MS和GC-MS确证，HPLC法测定降解产物的变化规律。

1. 2. 5 土壤修复试验 添加回收试验：称取空白土壤样品20 g，土壤二甲四氯添加水平分别为0.50、1.25和2.50 mg/kg，并设空白对照，在25 ℃下放置4 h。将上述土壤转用40 mL乙腈振荡提取1.5 h，加入5 g NaCl，4000 r/min离心5 min，吸取上清液30 mL，经3 g无水MgSO4吸水后4000 r/min离心5 min，取上清液20 mL用旋转蒸发仪于40 ℃下旋蒸至干，用2 mL乙腈定容后过有机相膜，转移至进样瓶中待测（程静等，2010）。

土壤修复试验：设灭菌土壤、灭菌土壤+内生真菌、不灭菌土壤和不灭菌土壤+内生真菌4个处理，在30 ℃恒温培养箱中恒温培养。准确称取阴干粉碎的土壤20 g放入三角瓶中，灭菌土壤在121 ℃下20 min灭菌后添加菌液，非灭菌土壤直接添加菌液进行土壤修复试验。土壤中二甲四氯含量为2.5 mg/kg，接入10.0 mL在PDB培养基中培养3 d的真菌培养液，同时设PDB培养基作对照，分别于培养0、3、5、7、10和14 d取样，每个样品3个重复，培养过程中在无菌环境下接入无菌水以防止土壤干燥（Chen et al.，2011a，2011b）。

1. 3 仪器条件

高效液相色谱仪1260 HPLC-UV，其色谱柱为安捷伦XDB C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm），流动相为甲醇∶水（含0.2%乙酸）=70∶30等度洗脱，UV波长230 nm，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，二甲四氯和产物4-氯-2-甲基苯酚在液相色譜的保留时间分别为6.3和7.6 min（简秋等，2015）。

液质联用仪TSQ Endura（赛默飞世尔科技公司）条件参照程静等（2010）的方法。色谱柱：Hypersil GOLD C18（2.1×100 mm 1.9 Micron）;流速：0.3 mL/min;进样量：5 μL;柱温：35 ℃;APCI离子源，正负离子模式;雾化气：氮气;离子传输管温度：320 ℃;喷针温度：400 ℃;流动相为甲醇和水，采用梯度洗脱。

气质联用仪为7890A-5975C（安捷伦科技有限公司），色谱柱DB-1701MS;氦气流速1 mL/min;采用不分流进样量模式，进样量1 μL;柱温箱采用程序升温：初始温度40 ℃保持3 min，8 ℃/min升至230 ℃，保持20 min;进样口温度250 ℃;接口温度280 ℃;EI离子源。

1. 4 数据处理分析

二甲四氯降解率（η，%）按公式（1）计算：

式中，C0为空白对照中二甲四氯总浓度（mg/L），Ct为t 时间样品培养液中二甲四氯残留浓度（mg/L）。

二甲四氯降解动力学方程采用指数回归方程（2）计算：

Ct=C0e-kt           （2）

式中，C0为二甲四氯初始浓度（mg/L）;Ct为t 时间二甲四氯残留浓度（mg/L）;k为降解速率常数;t为二甲四氯与内生真菌共培养的时间。

半衰期按照公式（3）计算：

t0.5=[Ln2k]

式中，t0.5为二甲四氯的降解半衰期。

2 结果与分析

2. 1 二甲四氯降解菌鉴定结果

初筛发现1株内生真菌对二甲四氯具有较好的降解效果，编号为E68，选取E68为研究对象，提交至菌种保藏中心，编号为GDMCC No.60162。

2. 1. 1 E68形态学鉴定 将E68接种至含有PDA培养基的培养皿（直径90 mm）中于28 ℃下培养，结果显示，E68的生长速度为4.5 mm/d，菌丝白色，辐射匍匐状，菌落中心与边缘厚度基本一致，菌落边缘呈雪花状，培养30 d后，表面长出黑色斑块（图1）。光学显微镜下观察，E68菌株的菌丝透明、有隔（图2）。采用环境胁迫、紫外照射和紫罗兰培养等多种方式培养，均未观察到该菌产孢现象。

2. 1. 2 序列分析 对E68的ITS、TUB和LSU进行PCR扩增，测序长度分别为547、412和911 bp，将序列提交至NCBI，ITS、TUB和LSU的序列号分别为KY797679.1、MW380415.1和MW520950.1。3个序列经NCBI比对，发现E68与NCBI已公布的炭角菌属（Xylaria sp.）同源性高达99%。根据Wendt等（2018）的方法，基于ITS和TUB序列串联分析，使用MEGA 6.0构建系统发育进化树（图3），结果显示其与Xylaria arbuscula的相似度最高;LSU序列与3株X. arbuscula（MN611207.1、KY610463.1和MN611203.1）菌株的相似性均高于99%，因此鉴定E68为树状炭角菌（X. arbuscula）。

2. 2 降解特性鑒定结果

2. 2. 1 降解pH优化 为评估pH对E68降解二甲四氯效果的影响，将无机盐培养基的pH分别调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，在30 ℃、150 r/min的摇床上连续培养7 d，结果（图4）显示，在pH 5.0时对二甲四氯的降解率最高，为95.93%;其次在pH 4.0时降解率为94.38%;pH 6.0～pH 9.0时降解率随着pH的升高而降低。所有空白对照的降解率均小于5.00%。因此，确定E68在酸性条件下降解二甲四氯的效果优于中性和碱性，最优pH为5.0。

2. 2. 2 降解温度优化 为研究温度效应，无机盐培养基设为pH 7.0，按试验设计将摇床设为5个不同温度，于150 r/min条件下连续培养7 d，结果（图5）发现温度为25 ℃时对二甲四氯的降解效率最高，为51.49%;随着温度升高或降低，E68对二甲四氯的降解效率均呈下降趋势，其在20、30、35和40 ℃时的降解率分别为45.61%、50.97%、23.98%和7.30%。空白对照的降解率小于5.00%。因此，确定E68最佳降解温度范围为25～30 ℃，后续试验选择28 ℃作为最优温度。

2. 2. 3 外源营养源优化 研究E68在分别添加葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、淀粉、酵母提取物和蛋白胨等营养源的MM培养基中降解二甲四氯的效果，以二甲四氯为唯一碳源作对照（CK），不添加E68的MM培养基为空白对照，在28 ℃、150 r/min的摇床上连续培养7 d，结果（图6）表明，添加淀粉、葡萄糖和蔗糖等营养源时，E68对二甲四氯的降解率明显高于二甲四氯作为唯一碳源的降解率，但添加牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨时降解率明显降低，可能是改变了该内生菌的代谢途径。因此，后续降解动力学研究中加入葡萄糖作为碳源。

2. 2. 4 E68降解二甲四氯动力学 在二甲四氯初始浓度为50.0 mg/L条件下，E68降解二甲四氯的最优条件为pH 5.0、温度28 ℃和添加0.5%的葡萄糖。在优化后的条件下，测定E68在无机盐培养基中对二甲四氯的降解动力学。分别于培养1、3、5、7、10和14 d后采样，结果显示，培养1 d后降解率高达88.46%，随时间降解率逐渐增高，分别为94.04%、95.20%、97.03%、97.71%和98.46%，其降解动力学方程为y=11.71e-0.233x，半衰期为3.0 d。

2. 3 降解产物鉴定结果

3个标准品甲基对苯醌、二甲四氯和4-氯-2-甲基苯酚在液相色谱上的保留时间分别为4.1、6.3和7.6 min，经时间比对4.1和7.6 min出现相同的峰（图7-A和图7-B）。液质联用仪上4-氯-2-甲基苯酚的保留时间为2.87 min，分子量m/z 141.0特征离子碎片为m/z 105.1和35.5（图7-C和图7-D）;虽然液相色谱上出现与甲基对苯醌保留时间一致的色谱峰，但在液质联用仪上未鉴定到甲基对苯醌。经气质分析，发现该代谢产物在气质联用仪上保留时间为15.5 min，通过数据库比对该产物确定为4-氯-2-甲基苯酚（4-Chloro-2-methylphenol）（图7-E和图7-F）。结合标准品、气质和液质联用最终鉴定出内生菌E68降解二甲四氯的主要产物为4-氯-2-甲基苯酚。该降解产物培养第5 d时在无机盐培养基中的含量为1.41±0.15 mg/L，随着时间延长含量缓慢下降，在培养7和14 d时的含量分别为1.26±0.09和1.09±0.17 mg/L。

2. 4 土壤修复试验结果

2. 4. 1 土壤添加回收试验 当土壤中二甲四氯添加水平分别为0.50、1.25和2.50 mg/kg时，按1.2.5的方法进行回收试验，结果（表2）显示，3个添加水平的平均回收率分别为100.07%、96.26%和98.71%，满足农药残留试验准则要求，证明该方法可有效提取土壤中残留的二甲四氯。

2. 4. 2 E68降解土壤中二甲四氯的效果 在灭菌和不灭菌土壤中分别加入E68，培养14 d后二甲四氯在灭菌土壤、灭菌土壤+E68、不灭菌土壤和不灭菌土壤+E68处理的降解率分别31.6%、57.5%、51.7%和85.5%，其降解动力学结果见表3。结果表明，二甲四氯在灭菌土壤中的降解率明显低于不灭菌土壤，可能与不灭菌土壤中含有丰富的微生物有关;与不添加E68的土壤相比，在灭菌和不灭菌土壤中分别接入内生菌E68后，二甲四氯的降解半衰期分别提高2.5和2.8倍。说明在土壤中添加E68可明显提高二甲四氯在土壤中的降解率。

3 讨论

内生菌广泛分布于植物体内，因具有促进植物生长和对污染物生物修复等优点而备受关注（傅婉秋等，2017;Deng and Cao，2017;刘剑金等，2019）。目前已分离出多个属的内生真菌可降解农药、塑化剂和环烃类污染物等，一些内生菌还具有缓解重金属对植物毒害等特点（Deng and Cao，2017;傅婉秋等，2017;韩飞等，2020）。田林双等（2007）、Xie和Dai（2015a，2015b）、Xie等（2016）研究证实拟茎点酶属（Phomopsis sp.）内生真菌对多种有机物有较好的降解效果。封国君（2017）从农药厂附近的植物中分离出多株可降解二甲四氯的内生真菌，并证实其具有很好的生物修复效果。Wang等（2017）也从甘蔗中分离出可降解敌草隆的内生真菌间型脉孢菌（Neurospora intermedia）。本研究在植物中分离出的炭角菌可有效降解二甲四氯，在土壤中也有明显的修复效果，丰富了降解有机物的内生菌资源。

环境因素（温度、pH和营养源）明显影响微生物降解有机物的效果，不同的内生菌只有在最优的条件下才能发挥其最佳降解效果（Stumpe and Marschner，2009）。Maqbool等（2016）报道认为真菌降解农药取决于环境的温度、pH和营养源等。Wu等（2017）报道C. gilardii T-1在25～37 ℃时对苯氧羧酸类除草剂2，4-D具有较好的降解效果，30 ℃时效果最佳，当达42 ℃时降解被抑制;该菌在pH 5～8时对2，4-D有较好的降解效果;还发现菌株C. gilardii T-1在30 ℃的无机盐培养基中对二甲四氯7 d的降解率高达99.7%。Xia等（2017）也发现温度和pH等显著影响降解菌对苯氧羧酸类除草剂的效果，额外添加营养源虽然可增加降解菌的生长，但对二甲四氯的降解效率无影响。本研究发现通过改变温度可明显影响E68对二甲四氯的降解率，温度在25～30 ℃时有较好的降解效果，可能是温度影响该菌的活性，从而导致对二甲四氯的代谢率下降。E68在酸性条件（pH 4.0～5.0）下对二甲四氯的降解效果更优，可能是由于分离获得的菌生活环境不同所致。添加牛肉膏、蛋白胨和酵母提取物明显降低E68对二甲四氯的降解率，推测这些营养源抑制降解二甲四氯酶的活性;添加葡萄糖、蔗糖和淀粉后明显提高该菌对二甲四氯的降解率，可能该菌以共代谢的方式降解二甲四氯（Mai et al.，2004）。內生菌存活于植物体内，通过摄取植物体内的营养物质生长，同时在外源营养物质的作用下诱导内生菌产生可降解有机污染物的酶，在酶的作用下可有效降解有机物。Urbaniak等（2019）、Nowak等（2020）研究表明，在土壤中添加外源物质可提高微生物的丰度和诱导产生多种降解二甲四氯的基因，提高微生物对二甲四氯的降解效果。

目前对于内生菌降解二甲四氯的机制尚不明晰。本研究通过标品和质谱等手段鉴定出E68降解二甲四氯的主要产物为4-氯-2-甲基苯酚，但该降解产物的含量较低，可能是一些产物的中间体，也可能是该菌产生酶催化二甲四氯生成4-氯-2-甲基苯酚，但其具体的酶学机制尚未清楚。Li等（2019）研究发现，炭角菌能有效降解西维因的机制可能与漆酶、细胞色素P450酶以及酯酶有关。因此，需进一步深入研究E68对二甲四氯的酶学降解机制。

近年来，利用植物内生菌定殖于植物体内对环境污染物进行生物修复已成为研究热点（傅婉秋等，2017）。但微生物修复环境污染物在实际应用中也存在诸多问题（Maqbool et al.，2016;Deng and Cao，2017;Kumar and Sharma，2019），如内生菌是如何定殖到植物中，以及如何与植物联合降解有机污染物尚不清楚，微生物投放到环境中的影响和生态学效应的研究也不够深入。本研究将分离获得的E68接种至土壤中能有效降低二甲四氯的含量，但试验是在室内条件下进行，对田间修复效果还有待进一步验证。内生菌与植物联合降解二甲四氯的研究尚未开展，其降解机制还需进一步探究。

4 结论

从飞机草中分离出的内生真菌E68在无机盐培养基和土壤中可有效降解二甲四氯，具有修复环境中二甲四氯污染的应用潜力。

参考文献：

程静，丁磊，蒋俊树，卢业举. 2010. 液相色谱串联质谱法测定谷物类农产品中苯氧羧酸类除草剂多残留[J]. 食品科学，31（20）：389-393. [Cheng J，Ding L，Jiang J S. Lu Y J. 2010. Determination of multi-residues of phenoxy acid herbicides in cereals by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science，31（20）：389-393.]

冯发运，朱宏，李俊领，陈安良，余向阳. 2015. 一株小飞蓬内生毒死蜱降解菌的分离鉴定及其降解特性初探[J]. 农药学学报，17（1）：89-96. doi：10.3969/j.issn.1008-7303. 2015.01.12. [Feng F Y，Zhu H，Li J L，Chen A L，Yu X Y. 2015. Isolation and identification of a chlorpyrifos degrading endophyte from Conyza canadensis（L.） Cronq and its degradation characteristics[J]. Chinese Journal of Pesticide Science，17（1）：89-96.]

封国君. 2017. 植物内生菌降解二甲四氯的菌株筛选及其降解特性研究[D]. 南宁：广西大学. doi：10.7666/d.Y3277333. [Feng G J. 2017. The screening plant endogenous microbial and degradation characteristics of the study for 2-methyl-4-chlorophenoxy acetic acid by fungal[D]. Nanning： Guangxi University.]

傅婉秋，谢星光，戴传超，吴清倩，贾永. 2017. 植物—微生物联合对环境有机污染物降解的研究进展[J]. 微生物学通报，44（4）： 929-939. doi：10.13344/j.microbiol.china. 160386. [Fu W Q，Xie X G，Dai C C，Wu Q Q，Jia Y. 2017. Progress in the degradation of environmental organic pollutants by plant-microorganism combination[J]. Microbiology China，44（4）：929-939.]

郭鹏豪，刘秀丽，崔颖鹏，廖康. 2013. 真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值评价[J]. 中国微生态学杂志，25（8）：922-924. doi：10.13381/j.cnki.cjm.2013.08.016. [Guo P H，Liu X L，Cui Y P，Liao K. 2013. The value of universal fungal primers Its1 and Its4 in the clinical identification of filamentous fungi[J]. Chinese Journal of Microecology，25（8）：922-924.]

韩飞，朱祥，张敏，赵炽娜，李俊凯. 2020. 内生真菌印度梨形孢对乙草胺残留动态的影响[J]. 河南农业科学，49（8）： 78-83. doi：10.15933/j.cnki.1004-3268.2020.08.009. [Han F，Zhu X，Zhang M，Zhao C N，Li J K. 2020. Effect of endophytic fungus Piriformospora indica on the residual dynamics of acetochlor[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，49（8） ： 78-83.]

简秋，郑尊涛，宋稳成. 2015. 三元除草剂二甲四氯·莠灭净·敌草隆在甘蔗及土壤中的消解特性研究[J]. 江西农业大学学报，37（5）：825-831. doi：10.13836/j.jjau.2015125. [Jian Q，Zheng Z T，Song W C. 2015. Degradation dyna-mics of MCPA·ametryn·diuron residues in sugarcane and soil[J].  Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，37（5）：825-831.]

刘剑金，刘子仪，罗山，罗永才，王学坚，张艳，申宴斌，何月秋. 2019. 采用生防菌YN48早期防控烟草黑胫病[J]. 江西农业学报，31（4）：65-68. doi：10.19386/j.cnki.jxnyxb. 2019.04.13. [Liu J J，Liu Z Y，Luo S，Luo Y C，Wang X J，Zhang Y，Shen Y B，He Y Q. 2019. Earlier prevention and control of tobacco black shank disease by spraying biocontrol bacterial strain YN48[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，31（4）：65-68.]

陶佳雨，洪亞军 ，陈雪梅 ，刘文韬 ，朱雪竹，苗雅慧. 2019. 功能植物内生细菌筛选及对多环芳烃降解效能研究[J]. 生态与农村环境学报，35（1）：83-90. doi：10.19741/j.issn. 1673-4831.2018.0112. [Tao J Y，Hong Y J，Chen X M，Liu W T，Zhu X Z，Miao Y H. 2019. Isolation，identification and pah-degrading performance of an endophytic bacterium Enterobacter sp. PRd5[J]. Journal of Ecology and Rural Environment，35（1）： 83-90.]

田林双，戴传超，赵玉婷，赵沫，勇应辉，王兴祥. 2007. 一株内生真菌单独及与水稻联合降解菲的研究[J]. 中国环境科学，27（6）：757-762. doi：10.3321/j.issn：1000-6923.2007. 06.008. [Tian L S，Dai C C，Zhao Y T，Zhao M，Yong Y H，Wang X X. 2007. The degradation of phenanthrene by endophytic fungi Phomopsis sp. single and co-cultured with rice[J]. China Environmental Science，27（6）： 757-762.]

燕勇，李卫平，高雯洁，沈志英，王恒辉，陈黎霞. 2008. rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用[J]. 中国卫生检验杂志，18（10）：1958-1961. doi：10.3969/j.issn.1004-8685. 2008.10.007. [Yan Y，Li W P，Gao W J，Shen Z Y，Wang H H，Chen L X. 2008. Application of rDNA ITS sequence analysis in fungus identification[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，18（10）：1958-1961.]

Chair K，Bedoui A，Bensalah N，Fernández-Morales F J，Sáez C，Ca?izares P，Rodrigo M A. 2017a. Combining bioadsorption and photoelectrochemical oxidation for the treatment of soil-washing effluents polluted with herbicide 2，4-D[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechno-logy，92（1）： 83-89. doi：10.1002/jctb.5001.

Chair K，Bedoui A，Bensalah N，Sáez C，Fernández-Morales F J，Cotillas S，Ca?izares P，Rodrigo M A. 2017b. Treatment of soil-washing effluents polluted with herbicide oxyfluorfen by combined biosorption-electrolysis[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research，56（8）：1903-1910. doi：10.1021/acs.iecr.6b04977.

Chen S H，Lai K P，Li Y N，Hu M Y，Zhao Y B，Zeng Y. 2011a. Biodegradation of deltamethrin and its hydrolysis product 3-phenoxybenzaldehyde by a newly isolated Strep-tomyces aureus strain HP-S-01[J]. Applied Micro-biology and Biotechnology，90：1471-1483. doi：10.1007/s00253-011-3136-3.

Chen S H，Yang L，Hu M Y，Liu J J. 2011b. Biodegradation of fenvalerate and 3-phenoxybenzoic acid by a novel Stenotrophomonas sp. strain ZS-S-01 and its use in bioremediation of contaminated soils[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，90：755-767. doi：10.1007/s00253-010- 3035-z.

Deng Z J，Cao L X. 2017. Fungal endophytes and their interactions with plants in phytoremediation： A review[J]. Chemosphere，168：1100-1106. doi：10.1016/j.chemosphere. 2016.10.097.

Ellegaard-Jensen L，Horemans B，Raes B，Aamand J，Hansen L H. 2017. Groundwater contamination with 2，6-dichlorobenzamide（BAM） and perspectives for its microbial removal[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，101（13）：5235-5245. doi：10.1007/s00253-017-8362-x.

Khan Z，Roman D，Kintz T，Alas M D，Yap R，Doty S. 2014. Degradation，phytoprotection and phytoremediation of phenanthrene by endophyte Pseudomonas putida，PD1[J]. Environmental Science and Technology，48：12221-12228. doi：10.1021/es503880t.

Kumar A，Sharma S. 2019. Microbes and enzymes in soil health and bioremediation[M]. Singapore： Springer Nature Singapore Pte Ltd：15-17.

Li F，Di L，Liu Y X，Xiao Q Y，Zhang X Y，Ma F Y，Yu H B. 2019. Carbaryl biodegradation by Xylaria sp. BNL1 and its metabolic pathway[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，167：331-337. doi：10.1016/j.ecoenv.2018.10. 051.

Liu M，Luo K，Wang Y S，Zeng A P，Zhou X M，Luo F，Bai L Y. 2014. Isolation，identification and characteristics of an endophytic quinclorac degrading bacterium Bacillus megaterium Q3[J]. PLoS One，9（9）：e108012. doi：10.1371/ journal.pone.0108012.

Loos，R，Tavazzi S，Mariani G，Suurkuusk G，Paracchini B，Umlauf G. 2017. Analysis of emerging organic contaminants in water，fish and suspended particulate matter （SPM） in the joint Danube survey using solid-phase extraction followed by UHPLCMS-MS and GC-MS analysis[J]. Science of the Total Environment，607-608：1201-1212. doi：10.1016/j.scitotenv.2017.07.039.

López-Pi?eiro A，Pe?a D，Albarrán A，Sánchez-Llerena J，Becerra D. 2013. Behavior of MCPA in four intensive cropping soils amended with fresh，composted，and aged olive mill waste[J]. Journal Contaminant Hydrology，152：137-146. doi：10.1016/j.jconhyd.2013.07.003.

Mai P，Stig O J，Aamand J. 2004. Mineralization and cometabolic degradation of phenoxyalkanoic acid herbicides by a pure bacterial culture isolated from an aquifer[J]. App-lied Microbiology and Biotechnology，56：486-490. doi：10.1007/s002530000589.

Maqbool Z，Hussain S，Imran M，Mahmood F，Shahzad T，Ahmed Z，Azeem F，Muzammil S. 2016. Perspectives of using fungi as bioresource for bioremediation of pesticides in the environment： A critical review[J]. Environmental Science and Pollution Research，23（17）：16904-16925. doi：10.1007/s11356-016-7003-8.

Matamoros V，Arias C A，Nguyen L X，Salvadó V，Brix H. 2012. Occurrence and behavior of emerging contaminants in surface water and a restored wetland[J]. Chemosphere，88（9）：1083-1089. doi：10.1016/j.chemosphere.2012.04. 048.

Nowak K M，Miltner A，Poll C，Kandeler E，Streck T，Pagel H. 2020. Plant litter enhances degradation of the herbicide MCPA and increases formation of biogenic non-extractable residues in soil[J]. Environment International，142：105867. doi：10.1016/j.envint.2020.105867.

Rehner S，Samuels G J. 1994. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences[J]. Mycological Research，98（6）：625-634. doi：10.1016/S0953-7562（09）80409-7.

Sam A T，Asuming-Brempong S，Nartey E K. 2017. Microbial activity and metabolic quotient of microbes in soils amen-ded with biochar and contaminated with atrazine and paraquat[J]. Acta Agriculturae Scandinavica，Section B-Soil & Plant Science，67（6）：492-509. doi：10.1080/09064710. 2017.1302504.

Simon U K，Groenewald J Z，Crous P W. 2009. Cymadothea trifolii，an obligate biotrophic leaf parasite of Trifolium，belongs to Mycosphaerellaceae as shown by nuclear ribosomal DNA analyses[J]. Persoonia：Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi，22（1）：49-55. doi：10.3767/003158509X425350.

Stumpe B，Marschner B. 2009. Factors controlling the biodegradation of 17β-estradiol，estrone and 17α-ethinylestradiol in different natural soils[J]. Chemosphere，74（4）：556-562. doi：10.1016/j.chemosphere.2008.09.072.

Tétard-Jones C，Edwards R. 2015. Potential roles for microbial endophytes in herbicide tolerance in plants[J]. Pest Mana-gement Science，72：203-209. doi：10.1002/ps.4147.

Trognitz F，Hackl E，Widhalm S，Sessitsch A. 2016. The role of plant–microbiome interactions in weed establishment and control[J]. FEMS Microbiology Ecology，92（10）：1-15. doi：10.1093/femsec/fiw138.

Urbaniak M，Mierzejewska E，Tankiewicz M. 2019. The stimu-lating role of syringic acid，a plant secondary metabolite，in the microbial degradation of structurally-related herbicide，MCPA[J]. PeerJ，7：e6745. doi：10.7717/peerj. 6745.

Vilgalys R，Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species[J]. Journal of Bacterio-logy，172（8）：4238-46. doi：10.1128/jb.172.8.4238-4246. 1990.

Wang Y H，Li H H，Feng G J，Du L W，Zeng D Q. 2017. Biodegradation of diuron by an endophytic fungus Neurospora intermedia DP8-1 isolated from sugarcane and its potential for remediating diuron-contaminated soils[J]. PLoS One，12（8）：e0182556. doi：10.1371/journal.pone.0182556.

Wendt L，Sir E B，Kuhnert E，Heitk?mper S，Lambert C，Hladki A I，Romero Andrea I，Luangsa-ard J J，Srikitikulchai P，Per?oh D，Stadler M. 2018. Resurrection and emendation of the Hypoxylaceae，recognized from a multigene phylogeny of the Xylariales[J]. Mycol Progress，17：115-154. doi：10.1007/s11557-017-1311-3.

Woudenberg J H C，Aveskamp M M，Gruyter J D，Spiers A G，Crous P W. 2009. Multiple Didymella teleomorphs are linked to the Phoma clematidina morphotype[J]. Persoo-nia：Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi，22（1）：56-62. doi：10.3767/003158509X427808.

Wu X W，Wang W B，Liu J W，Pan D D，Tu X H，Lü P，Wang Y，Cao H Q，Wang Y W，Hua R M. 2017. Rapid biodegradation of the herbicide 2，4-dichlorophenoxyacetic acid by Cupriavidus gilardii T-1[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，65（18）：3711-3720. doi：10. 1021/acs.jafc.7b00544.

Xia Z Y，Zhang L，Zhao Y，Yan X，Li S P，Gu T，Jiang J D. 2017. Biodegradation of the Herbicide 2，4-dichlorophenoxyacetic acid by a new isolated strain of Achromobacter sp. LZ35[J]. Current Microbiology，74：193-202. doi：10. 1007/s00284-016-1173-y.

Xie X G，Dai C C. 2015a. Degradation of a model pollutant ferulic acid by the endophytic fungus Phomopsis liquida-mbari[J]. Bioresource Technology，179：35-42. doi：10. 1016/j.biortech.2014.11.112.

Xie X G，Dai C C. 2015b. Biodegradation of a model allelochemical cinnamic acid by a novel endophytic fungus Phomopsis liquidambari[J]. International Biodeterioration and Biodegradation，104：498-507. doi：10.1016/j.ibiod. 2015.08.004.

Xie X G，Huang C Y，Fu W Q，Dai C C. 2016. Potential of endophytic fungus Phomopsis liquidambari for transformation and degradation of recalcitrant pollutant sinapic acid[J]. Fungal Biology，120（3）：402-413. doi：10.1016/j.funbio.2015.11.010.

（責任编辑 麻小燕）