水稻细菌性条斑病抗性基因bls2 SSR分子标记开发

罗登杰 万瑶 覃雪梅 施力军 张慧 李容柏 刘芳

摘要：【目的】開发水稻细菌性条斑病（简称细条病）抗性基因bls2 SSR分子标记，为利用分子标记辅助选择培育水稻细条病抗性品种提供技术支撑。【方法】基于本课题组前期对细条病抗性基因bls2初定位结果，设计SL03与SL04分子标记区间的SSR引物，从中筛选出在亲本间具有多态性的引物，用于检测由普通野生稻DY19与籼稻9311为亲本构建的BC3F2群体中各单株的基因型，并结合细条病病斑长度测定结果，利用MapQTL 5.0精细定位bls2基因，鉴定出与之紧密连锁的SSR分子标记，并比较单标记或双标记的选择效果。【结果】通过田间细条病抗性鉴定发现，BC3F2群体抗、感分离符合理论比1∶3的孟德尔单基因遗传分离规律。利用筛选鉴定出的11个多态性分子标记对BC3F2群体共244个单株进行单株基因型检测，并结合单株抗性表型值，将细条病抗性基因bls2精细定位于2号染色体上RM13592和RM13599分子标记之间，物理距离240 kb;RM13592和RM13599分子标记在BC3F2群体上的分离比均符合1∶2∶1的单基因遗传分离规律。利用单标记和双标记均可有效选择BC3F3群体中的感病单株和抗病单株。RM13592和RM13599分子标记辅助选择符合率分别达92.62%和93.44%，使用双标记的选择符合率为93.44%。【结论】RM13592和RM13599与细条病抗性基因bls2紧密连锁，具有易于PCR扩增，易于识别，准确性高的特点，可作为水稻抗细条病育种上分子标记辅助选择的有效标记。

关键词： 水稻;细菌性条斑病;bls2基因;分子标记辅助选择

中图分类号： S511.035.3                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1167-07

Abstract：【Objective】SSR markers closely linked to the resistance gene bls2 against bacterial leaf streak（BLS） were developed in order to provide technical support for the cultivation of BLS-resistant rice varieties by molecular marker-assisted selection（MAS）. 【Method】Based on the preliminary mapping of the resistance gene bls2， the SSR markers were designed in the interval of markers SL03 and SL04 and those primers with polymorphism between parents were screened to detect the individual genotype in BC3F2 population which was bred by common wild rice DY19 and indica rice 9311 as parents. Combined with the measurement results of the length of lesions caused by BLS， bls2 gene was fine mapped by software MapQTL 5.0， therefore the SSR markers closely linked to bls2 were determined and the selection effects of unilateral and bilateral markers were compared. 【Result】It was found that the segregation of resistant and susceptible plants in BC3F3 population accorded with Mendelian monogene segregation of 1∶3 by resistance identification to BLS in field. Eleven pairs of polymorphic markers between parents were screened to detect the genotypes of 244 individual plants in BC3F2 population， then the location of the resistance gene bls2 was mapped to the physical distance of 240 kb between markers RM13592-RM13599 on chromosome 2 combined with individual phenotype identification. Both markers RM13592 and RM13599 segregated at ratio of 1∶2∶1， which was completely agreement with monogene searegation law. In BC3F3 population，the use of unilateral marker RM13592 or RM13599 and the simultaneous use of bilateral markers were effective for the selection of susceptible and resistant plants. The MAS selection accuracies of unilateral markers RM13592 and RM13599 were 92.62% and 93.44% respectively，while the selection accuracy of bilateral markers was 93.44%. 【Conclusion】RM13592 and RM13599 are closely linked to the resistance gene bls2 and have the characteristics of easy PCR amplification，easy identification and high accuracy，so they can be used as effective markers of MAS in breeding rice variety against BLS.

Key words： rice; bacterial leaf streak; bls2 gene; molecular marker assisted selection

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32060473）; Guangxi Natural Science Foundation（2019GXNSFAA185043）

0 引言

【研究意义】水稻（Oryza sativa L.）为禾本科稻属一年生水生草本，作为世界三大粮食作物之一，在我国超过50%的人以其为主粮。水稻细菌性条斑病（Bacterial leaf streak，BLS）简称水稻细条病，是由革兰氏阴性菌黄单胞菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola，简称XooC）侵染引起，是我国调运植物检疫的危险性病害之一，亚洲和大洋洲的部分国家将其列为重要的检疫性水稻病害。农民常采用噻菌铜、噻唑锌、代森铵和农用链霉素等药剂防治细条病（梁玉娥，2016）。但滥用农药对生态环境造成很大的危害，随着人们对食品安全和生态环境保护意识的不断提高，挖掘抗细条病种质资源的抗病基因，并利用分子生物学手段培育和改良抗病新品种，是控制该病害最经济有效和环保的途径，从而实现水稻优质、稳产和高产的目标（Zhang，2007）。目前，虽然分子标记辅助选择（Marker assisted selection，MAS）技术已被广泛运用于选育水稻品种，但在水稻抗细条病育种中真正被应用的抗性基因非常有限。因此，应加强对水稻抗细条病基因的发掘和分子定位，开发出可用于辅助育种的分子标记，可大幅度提高抗细条病种质资源的利用效率，缩短育种时间，对水稻抗细条病育种和生产具有重要意义。【前人研究进展】目前，关于水稻抗病基因分子标记开发及应用的研究已有较多报道。Chen等（2000）使用Xa21基因的11个分子标记对明恢63和IRBB21杂交的F2群体进行分析，并利用分子标记辅助回交育种法获得改良的抗白叶枯病材料Minghui 63。谭彩霞等（2005）通过RM205、RM245、RM201、RM167和Y529分子标记鉴定出2个抗纹枯病的数量性状位点（QTLs），同时利用这些分子标记对相同背景下的不同纯合系进行辅助育种，结果发现其在纹枯病发病程度上存在极显著差异，2个位点上所在的抗性等位基因qSB-9和qSB-11单独存在时，分别减轻病级1.2级左右，同时存在时可减轻病级2级左右。周雷等（2016）利用抗稻瘟病基因Pi25上具有特异性功能的SNP分子标记对携带抗性基因Pi25的谷梅2号与9311杂交构建的F2群体进行辅助选择，结果发现利用这些SNP分子标记可有效进行辅助育种。郑祥正（2020）对IRBL1-CL（Pi1）与LTH杂交构建的F2世代分离群体进行Pik-Indel分子标记辅助选择，结果表明利用Pik-InDel分子标记能精确选择含抗病基因Pik的材料。但有关水稻细条病抗性基因在分子标记开发及应用的报道较少。陈志伟等（2006）筛选出3个与细条病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记，并应用于高抗细条病品种Acc8558的抗病基因导入到高感细条病品种珍汕97B的回交育种中，结果发现感病亲本的细条病抗性明显提高。李齐向等（2012）以高抗细条病水稻品系Dular（携带qBlsr-11-1）和H359R（携带qBlsr5a、qBlsr3d和qBlsr5b）为親本进行杂交育种，并利用前期筛选出与抗病基因紧密连锁的SSR分子标记，通过混合选择结合分子标记辅助育种法将QTL聚合在一起，结果表明该方法可有效聚合2～4个目标QTLs，是培育广谱抗细条病品种的有效途径。【本研究切入点】目前已报道的细条病抗性QTL约13个，但仅有3个抗性QTLs被精细定位。其原因是由于鉴定发现的QTLs抗性效应较小，主效QTLs极少，使定位和克隆工作困难，能真正应用到水稻生产上的抗性基因资源极其有限。在抗性育种中，主效基因控制的抗性是一种重要的抗源类型，更具有应用价值。本课题组前期研究发现将来自普通野生稻材料DY19的抗性基因bls2定位于2号染色体的SL03与SL04分子标记之间，物理距离为4 cM（施力军等，2019）。由于bls2是主基因，且普通野生稻与栽培稻同属于AA染色体组，可通过杂交育种方法将bls2基因导入栽培稻品种中，然后使用分子标记辅助育种技术可有效加速育种进程。但目前未见开发与bls2基因紧密连锁的分子标记的研究报道。【拟解决的关键问题】设计抗性基因bls2的SL03与SL04分子标记区间引物，并筛选在亲本间具有多态性的SSR分子标记，利用普通野生稻DY19与籼稻9311构建的BC3F2群体对bls2基因进行精细定位，再利用与bls2基因紧密连锁的单侧或双侧标记，对BC3F3群体进行标记基因型和抗性表型分析，比较不同标记的选择效果，为利用分子标记辅助培育水稻细条病抗性品种提供技术支撑。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

供试水稻品种为高感细条病的籼稻9311和高抗细条病普通野生稻材料DY19，通过二者杂交构建BC3F2群体及其后代BC3F3群体。供试菌株为广西强致病力水稻细条病菌株JZ28，由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室何勇强教授提供。主要试剂：rTaq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、CTAB、丙烯酰胺、甲醛、硝酸银和三（羟甲基）氨基甲烷等购自北京索莱宝科技有限公司;硼酸购自天津博迪化工有限公司;三氯甲烷、氢氧化钠和无水乙醇均为分析纯。主要仪器设备：PCR扩增仪（Bio-Rad，美国）、电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）和数显恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司）。

1. 2 抗性鉴定

供试材料种植于广西大学农学院科学研究试验基地大田，采用单株插秧种植，株行距15 cm×25 cm，田间管理按常规大田管理方法进行。参考赵严等（2018）的针刺法进行细条病菌株JZ28接种：于水稻分蘖盛期，选取各材料生长势基本一致的植株，在其2张完全展开叶片上进行针刺接种，每片叶6个针刺点。接种后20 d，对田间细条病发病情况进行病情调查，记录每个植株病斑值，取均值。参照国际水稻所（IRRI）的鉴定标准，以病斑长度1.5 cm作为抗、感的分界线，大致为抗病和感病2种类型，进一步细分为6种抗性级别：病斑长度0 cm为免疫（I）;病斑长度0.1～0.5 cm为高抗（HR）;病斑长度0.6～1.0 cm为抗（R）;病斑长度1.1～1.5 cm为中抗（MR）;病斑长度1.6～2.5 cm为易感（S）;病斑长度≥2.5 cm为高感（HS）。

1. 3 SSR分子标记筛选

从Gramene网站（http：//www. gramene.org）下载水稻基因组序列信息。基于本课题组前期对细条病抗性基因bls2初定位结果（施力军等，2019），在SL03与SL04分子标记区间内设计合成14对新的SSR引物，筛选出在亲本间具有多态性的SSR引物，用于检测BC3F2群体中各单株的基因型。依据单株基因型检测结果，利用JoinMap 3.0构建遗传连锁图，并结合细条病病斑长度测定结果，用MapQTL 5.0进行区间作图，对bls2基因进一步精细定位，筛选获得与之紧密连锁的SSR分子标记。

1. 4 SSR分子标记选择效果评价

从与bls2基因紧密连锁的SSR分子标记中进一步筛选出具有易于PCR扩增和识别特点的单侧或双侧分子标记，利用其从BC3F3群体中鉴定出纯合抗病标记基因型、杂合标记基因型和纯合感病标记基因型的单株，同时测量各单株的病斑长度。以同种标记基因型单株病斑长度的均值为评价指标，分析各种标记基因型之间病斑长度差异，从而计算BC3F3群体中标记基因型和抗性表型的符合率，以此评价单侧或双侧分子标记的选择效果。

1. 5 SSR多态性分析

参照黄萱等（2004）的CTAB法提取叶片DNA。以提取DNA为模板进行PCR扩增。反应体系10.0 μL：10×Bffuer 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.1 μL，SSR引物（10 μmol/L）0.6 μL，dNTP（10 μmol/L）0.2 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/L）0.1 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，54～63 ℃（依据引物实际的Tm值调整）30 s，72 ℃ 45 s，进行34个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物于4 ℃冰箱保存。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后显色分析法检测PCR产物。

1. 6 统计分析

利用DPS 7.5对病斑长度数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 抗性基因bls2精细定位及其连锁SSR分子标记筛选结果

通过高感细条病的籼稻9311与高抗细条病普通野生稻材料DY19杂交共构建276株BC3F2群体，对该群体单株进行田间抗性鉴定，结果如表1所示。抗病单株数为73株，其中高抗、抗和中抗级别分别为17、21和35株;感病单株数为203株，其中感和高感级别分别为83和120株。经χ2测验结果显示，BC3F2群体抗、感分离符合理论比1∶3（χ2=0.24<χ20.05，1=3.84）的孟德尔单基因遗传分离规律。从设计合成的14对SSR引物中筛选出11对在亲本间具有多态性的SSR引物，即获得11个多态性分子标记，利用其引物对BC3F2群体进行单株基因型检测，并使用JoinMap 3.0构建遗传连锁图，结果如图1-A所示。结合单株表型值，利用MapQTL 5.0对染色体目标区段扫描，结果发现在RM13592与RM13599分子标记之间存在1个LOD值为33.58（远超过阈值3.0）的最大峰（图1-B），表明抗性基因bls2精细定位为RM13592与RM13599分子标记之间，物理距离240 kb。

鉴于RM13592和RM13599是与抗性基因bls2两侧最近的分子标记，且2个标记PCR扩增效果好，能有效地区分纯合抗病标记基因型、杂合标记基因型和纯合感病标记基因型（图2）。因此，将这2个标记作为后续分子标记辅助选择的候选标记，其引物序列如表2所示。

2. 2 分子标记基因型检测及细条病抗性表现

利用RM13592和RM13599分子标记检测BC3F3群体共244个单株的基因型，结果表3所示。其中，RM13592的纯合抗病标记基因型（bb）单株72个，杂合标记基因型（Bb）单株117个，纯合感病标记基因型（BB）单株55个，分离比符合1∶2∶1（χ2=2.78<χ20.05，2=5.99）的单基因遗传分离规律;而RM13599的纯合抗病标记基因型（cc）单株72个，杂合标记基因型（Cc）单株115个，纯合感病标记基因型（CC）单株57个，分离比也符合1∶2∶1（χ2=2.63<χ20.05，2=5.99）的单基因遗传分离规律，表明2个分子标记不存在偏态分布。

测定2种分子标记基因型单株的病斑长度，结果如表3所示。利用单标记或双标记选出的纯合抗病标记基因型（bb、cc和bbcc）单株病斑长度均值分别为1.22、1.16和1.15 cm，三者间差异不显著（P>0.05，下同），但这3种纯合抗病标记基因型单株的病斑长度均值均与高感细条病亲本9311、3种杂合标记基因型（即Bb、Cc和BbCc）和纯合感病标记基因型（BB、CC和BBCC）单株的病斑长度均值间差异均达显著水平（P<0.05，下同）;3种杂合标记基因型（Bb、Cc和BbCc）和纯合感病标记基因型（BB、CC和BBCC）单株的病斑长度均与高感细条病亲本9311的病斑长度差异不显著;3种纯合抗病标记基因型（bb、cc和bbcc）单株与高抗细条病普通野生稻亲本DY19的病斑长度差异也不显著。可见，利用单标记和双标记均可有效选择BC3F3群体中的感病单株和抗病单株。

2. 3 RM13592和RM13599分子标记辅助选择的准确性

计算BC3F3群体244个单株中单标记和双侧标记基因型与田间抗性表型的符合率，结果如表4所示。抗病单株有60个（抗病亚群），感病单株有184个（感病亚群），抗、感分离符合1∶3（χ2=0.01<χ20.05，1=3.84）的單基因遗传分离规律，说明群体抗性受1对隐性主基因控制。利用RM13592分子标记检测抗病亚群60个单株和感病亚群184个单株的基因型，结果显示抗病标记基因型单株有57个，基因型与田间抗性表型符合率为95.00%;感病标记基因型单株有169个，基因型与田间抗性表型符合率为91.85%，故RM13592分子标记对整个BC3F3群体的分子标记辅助选择符合率为92.62%。同上分析，RM13599分子标记对整个BC3F3群体的分子标记辅助选择的符合率为93.44%;运用双标记对整个BC3F3群体的分子标记辅助选择符合率为93.44%。综上所述，使用单标记和双标记对BC3F3群体中感病和抗病单株的选择均具有较高的准确性。

3 讨论

目前仅有3个细条病抗性基因（或QTL）被精细定位的报道。Xie等（2014）利用一套次级染色体片段置换系将1个抗性效应较大的QTL即qBlsr5a（表型贡献率为12.8%～15.9%）精确定位到30 kb范围内，在此区间内只能预测到3个基因，其中LOC_Os05g01710很可能是qBlsr5a的候选基因;Triplett等（2016）研究发现，美国本土品种Carolina Gold Select的细条病菌株抗性基因Xo1定位于4号染色体长臂1.09 Mb范围内，但该基因不抗亚洲细条病菌株;Wang等（2020）利用24个重叠染色体置换系将1个效应较小的QTL即qBlsr3d（表型贡献率为6.4%～9.8%）定位至3号染色体上81 kb范围内，找到了一个关键的候选基因LOC_Os03g03570，其功能尚待验证。水稻细条病病原菌与同属的水稻白叶枯病原菌黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）亲缘关系很近，目前已鉴定出至少40个白叶枯病抗性基因，但仅11个抗性基因被成功克隆（Jiang et al，2020）。相比之下，虽然水稻细条病抗性基因的定位研究取得了一定进展，但大多数是抗性效应较小的QTLs，抗性表型受环境影响较大，因而基因克隆研究进展缓慢。本研究将水稻细条病抗性基因bls2精细定位至2号染色体RM13592和RM13599之间240 kb范围内。由于bls2基因抗细条病效应大，因此本研究获得的该基因定位結果为bls2基因的克隆和功能研究打下基础。

水稻细菌性条斑病的抗性表现既受基因控制，又受病原菌、温度、湿度、土壤肥力等环境因素影响。传统育种的表型选择准确度往往不高、效率低（王欣，2017）。分子标记辅助育种是对分子标记基因型的鉴定与选择，不受环境因素的影响，相对于传统育种更加准确、高效，该方法现已广泛应用于作物遗传育种。李齐向等（2012）利用SSR分子标记对水稻细条病抗性QTL进行辅助筛选及基因聚合育种，结果发现紧密连锁的SSR分子标记与目标QTL的距离为0.4～4.9 cM，可满足分子标记辅助育种的要求。本研究筛选出的与抗性基因bls2紧密连锁的分子标记RM13592和RM13599均满足分子标记辅助选择的定位距离要求。利用含bls2基因的BC3F3群体对这2个标记进行选择效果评估，结果表明无论是单标记还是双标记选择，选择符合率均达92.00%以上，说明这2个分子标记均可应用于育种实践中，实现对bls2基因的定向选择。可见，水稻细条病抗性基因的分子标记辅助选择育种，通过检测与抗性基因位点连锁的分子标记，分析水稻材料的标记基因型，可较准确判断水稻植株的细条病抗性，在苗期就可鉴定出高抗细条病的单株，该方法不仅节约生产成本，且大幅度提高选择效率，极大缩短水稻细条病抗性品种的育种周期。今后应利用本研究开发的这2个分子标记进行高效辅助选择育种，从而培育出高抗细条病的水稻新品种。

4 结论

RM13592和RM13599与细条病抗性基因bls2紧密连锁，具有易于PCR扩增，易于识别，准确性高的特点，可作为水稻抗细条病育种上分子标记辅助选择的有效标记。

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（责任编辑 陈 燕）