基线诱导型共刺激因子水平与食管癌术后病人预后的相关性分析

刘贞 赵怀才 刘东岳 李秀昌 刘鹏飞

食管癌早期多无明显症状，随着疾病的进展出现进行性吞咽困难[1]。有研究表明，对于食管癌T1a和T1b期病人内窥镜切除术是首选的治疗方式[2]。一项荟萃分析显示，接受食管癌切除术的病人，约半数病人在术后2年内出现复发、疾病进展[3]。Enane等[4]回顾性研究指出，不同分化程度食管癌术后预后存在差异；袁俊等[5]研究指出肿瘤淋巴转移与食管癌预后关系密切，认为高肿瘤浸润淋巴细胞是食管癌切除术术后独立的良好预后因素。关于食管癌免疫逃逸机制的研究发现，调节性T细胞(Tregs)分泌表达的诱导型共刺激因子(Inducible costimulator，ICOS)在维持免疫耐受中起重要作用，并参与了免疫逃逸和抑制抗肿瘤免疫应答过程[6]。关于胃癌预后的相关性因素分析指出，ICOS表达水平可作为预测预后不良的生物标志物，靶向ICOS-L/ICOS共刺激轴可作为治疗胃癌的潜在治疗方法[7]。本研究探讨基线ICOS表达水平与食管癌切除术病人短期预后的相关性。

对象与方法

一、对象

2016年6月～2018年4月我院胸外科诊断及治疗的食管癌病人139例，其中男性84例，女性55例；年龄40～70岁，平均年龄(55.96±9.86)岁；随访2年后，120例病人完成随访。120例病人中出现预后不良55例，作为预后不良组，未出现预后不良65例，作为预后良好组；以ICOS表达水平中位数为界值，分为ICOS低表达组(60例)和ICOS高表达组(60例)。纳入标准：(1)符合食管癌诊断标准，并通过术前病理检测确诊为食管癌[8]；(2)无肺，肝，脑，肾和肾上腺等转移；(3)术前病理检测为食管鳞状细胞癌；(4)签署知情同意书。排除标准：合并其他器官或组织肿瘤；合并严重心肺功能疾病、营养状况差及呈恶液质样者；继发性食管癌；瘤体已与主要器官，如主动脉、气管等紧密粘连而不能切除；依从性差，不配合随访。本研究经我院伦理委员委员会批准。

二、方法

1.治疗方法：参照2014年版中华医学会内镜学分会制订的《中国早期食管癌筛查及内镜诊治专家共识意见》的手术治疗原则及方案进行治疗[9]。

2.基线ICOS表达水平检测：利用免疫组织化学染色技术，经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋以5 μm切片，石蜡切片以二甲苯脱蜡，乙醇水化；完成后采用0.3%双氧水孵育15分钟，微波抗原修复15分钟；冷却至室温后充分水洗，采用10%牛血清白蛋白封闭30分钟；滴加经PBS稀释的ICOS抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜；使用通用型HRP生物标记素标记二抗孵育30分钟；DAB显色后，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片镜检。光学显微镜下随机观察10个高倍视野，结合染色强度进行半定量评分。评分标准[9]：计数阳性细胞百分比，<25%为1分，25～50%为2分，>75%为3分。细胞着色轻度：淡黄色为1分，棕黄色2分，棕褐色为3分。以阳性细胞百分比得分×着色强度得分为最终评分，1～3分为低表达，≥4分为高表达。

3.观察指标：收集两组病人人口学资料，包括年龄、性别、BMI等；既往史，包括高血压、手术史等；实验室及病理检查资料，包括肿瘤TNM分期、肿瘤位置、大小、手术入路、手术方式、淋巴清扫情况等。

4.随访：两组病人均门诊随访2年，随访术后预后情况，随访截止时间2020年4月27日。参照世界卫生组织(WHO)发布的实体瘤疗效评价标准(RECIST1.1)评定，分为4个等级[10]：进展、稳定、部分缓解、完全缓解。预后不良=进展；预后良好=稳定+部分缓解+完全缓解。

三、统计学处理

结果

1.随访结果：随访截止时间2020年4月27日，139例病人共计120例病人完成随访，失访率为13.67%，最终纳入120例食管癌病人，共计55例病人出现预后不良。见表1。

2.预后不良组与预后良好组病人临床资料比较：预后不良组与预后良好组淋巴结转移、分化程度、淋巴结清扫数目、基线ICOS表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，其余组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 预后不良组与预后良好组病人临床资料比较

3.食管癌切除术病人短期预后不良风险预测因素分析：Logistics多因素回归分析显示，淋巴结转移(OR=0.132)、分化程度(OR=0.359)基线ICOS低表达(OR=0.303)是食管癌切除术术后病人预后不良的危险因素。见表2。

表2 多因素Logistics分析

4.两组病人预后不良风险比较：K-M生存分析曲线显示，基线ICOS高表达组病人预后不良风险低于基线ICOS低表达组(log-rank χ2=7.934，P=0.005)。见图1。

图1 两组食管癌切除术术后病人预后不良风险发生风险比较

5.基线ICOS表达水平预测病人预后不良的效能：基线ICOS 表达水平预测病人预后不良风险的AUC为0.726，特异度为72.73%、敏感度为67.69%，优于分化程度、淋巴结转移。见图2，表3。

图2 基线ICOS 表达水平预测食管癌切除术术后病人预后不良的ROC曲线

表3 基线ICOS表达水平预测食管癌切除术术后病人预后不良的效能

讨论

食管癌是最常见的恶性肿瘤，5年总体存活(OS)<20%，每年导致超过40万人死亡[11]。食管癌切除术是治疗食管癌的主要方式，然而食管癌切除术术后约50%病人出现预后不良，影响术后生存期[12]。术后病人预后分层在制定最佳治疗方式中起着至关重要的作用。目前，用于预测食管癌切除术术后预后情况的因子众多，包括肿瘤分化程度、淋巴结转移等。ICOS是一种由Tregs分泌的细胞因子。多项研究表明，ICOS与多种肿瘤疾病的疾病进展和预后不良相关联[13-15]。尽管机制尚未完全了解，但关于胃癌、直肠癌的研究发现高ICOS表达水平与病人良好预后呈正相关；Solinas等[16]研究证实，ICOS可抑制对宿主的有害免疫反应，表明ICOS参与了肿瘤病人预后过程。本研究通过检测食管癌病人基线ICOS表达水平，探讨其与病人预后的相关性。

ICOS属B7-CD28免疫球蛋白超家族，是在活化T细胞上表达的活化共刺激免疫检查点，参与调节T细胞活化和适应性免疫应答，其配体ICOSL在抗原呈递细胞和肿瘤微环境中的肿瘤细胞上高表达[17]。ICOS和ICOSL的表达与激活免疫反应诱导的可溶性因子的释放有关。ICOS和ICOSL的结合在T细胞亚群的多样性中产生T细胞活化和效应子功能，以及由调节性T细胞介导的抑制免疫活性，在增强抗肿瘤免疫应答中具显著作用。一项关于结直肠癌研究发现，ICOS的高表达与结直肠癌病人的总生存期(OS)显着相关(n=230，P<0.001)；多变量分析证明，ICOS表达是独立的预后因素，证实ICOS参与了肿瘤的预后过程。在本研究中K-M曲线分析显示，ICOS高表达组病人预后不良风险低于ICOS低表达组(log-rank χ2=5.971)；多因素分析显示，ICOS低表达水平为病人术后预后不良的独立风险因素。ICOS主要在CD4+T细胞上表达，表达水平与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)增加和程序性死亡(PD-1)表达有关；介导了调节T细胞功能的关键双向信号，促进和维持T细胞反应的正性第二信号和调节T细胞耐受性的负性第二信号。同时在调节活化T细胞和效应T细胞中起重要作用，可促进肿瘤病人Th1效应子反应，通过肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和MDSCs在内的肿瘤相关髓样细胞通讯来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[18-19]。ICOS与其配体ICOSL结合通过TAM或肿瘤细胞信号通路中参与CD4+T细胞细胞功能，并可响应在非造血细胞上的炎症信号传导。这可能有助于改善食管癌病人术后预后，降低预后不良风险。

淋巴结转移及低分化程度是食管癌病人术后预后不良的风险因素。肿瘤细胞增殖的复杂过程是由主转录因子(TF)MYC协调，TF将祖细胞定型转入谱系，与MYC共同驱动指数增殖，向正向分化，最终导致细胞周期退出。分化程度与自我复制涉及增殖与该前向分化的脱钩。细胞凋亡p53(TP53)或其主要辅因子的主要调节剂可抑制癌症细胞的无限增殖，但在低分化食管癌病人中该机制被普遍灭活，癌细胞的生长、浸润和转移无显著限制因素，同时，肿瘤内形成的大量新生血管网为癌肿的增殖、迁移提供了生存条件，更易出现淋巴结转移。淋巴结转移是食管癌治疗的重要预后因素和决定性因素，Kashima等[20]一项关于淋巴结转移的食管癌10年生存率分析显示，淋巴结转移病人预后不良比例明显增高，表明发生淋巴结转移影响食管癌预后。

本研究通过绘制ROC曲线显示，ICOS表达水平预测食管癌病人术后预后不良风险的AUC为0.726，特异度为72.73%、敏感度为67.69%，优于淋巴结转移、分化程度。说明ICOS表达水平预测食管癌病人术后预后具显著效能，能够有效帮助临床医生识别食管癌病人术后预后不良人群。但限于本研究样本量较少且仅纳入食管鳞状细胞癌病人，最终结果可能产生一定的偏倚，后期还需要增大样本量，纳入其他型食管癌病人来对本研究结论做进一步验证。

综上所述，淋巴结转移、分化程度、基线ICOS低表达是食管癌病人术后预后不良的危险因数，其中ICOS低表达可作为预测食管癌病人术后预后不良风险的重要指标。