不同水平绿原酸对肉兔生长性能、抗氧化性能和肝脏微观结构的影响

刘静慧，李冲，徐美利，牛志平，侯玉春，刘亚娟，陈宝江*

(1. 河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2. 中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；3. 晨光生物科技集团股份有限公司，河北 邯郸 056000；4. 廊坊市永清县农业农村局，河北 廊坊 065600；5. 河北农业大学山区研究所，河北 保定 071000；6. 河北省山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000)

随着我国饲料全面禁抗，抗生素替代品的需求进一步增加，其中植物提取物是抗生素替代品研究开发中的热点。绿原酸(chlorogenic acid,CGA)是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，是植物有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生一种苯丙素类化合物，其广泛存在于多种植物中，以金银花、杜仲中含量较高。绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝利胆、抗肿瘤等多种生物活性[1]，在动物生产中有一定的应用。伏桂华等[2]在黄河鲤鱼饲粮中添加0.045%绿原酸，日增重显著提高，肌肉中粗蛋白含量提高、粗脂肪含量降低，肌肉品质有所改善。王宇等[3]在仔猪日粮中添加1 000 mg/kg绿原酸，料重比显著降低，仔猪血清IgG含量显著提高，免疫功能增强，小肠黏膜结构形态得到改善。但绿原酸在兔生产中的研究报道较少，限制了其在兔生产中的应用。因此本试验通过饲喂含不同水平绿原酸的饲粮，研究其对伊拉肉兔生长性能、血清抗氧化性能以及肝脏抗氧化性能和肝脏微观结构及的影响，为其在兔生产中的进一步研究和应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和分组

选择35日龄断奶伊拉兔60只(由河北农业大学畜牧教学基地提供，生长试验全程在河北农业大学畜牧教学基地完成)，体重相近，公母各半，采用单因素完全随机设计，分为5组，每组12只。其中：对照组饲喂基础饲粮；抗生素组在基础饲粮中添加18.80 mg/kg杆菌肽锌和15.51 mg/kg喹烯酮；绿原酸组按添加剂量分成3组，即：CGA500组、CGA1000组和CGA2000组，在基础饲粮中分别添加500、1 000和2 000 mg/kg绿原酸。

1.2 饲粮设计

绿原酸(有效含量≥80%)由晨光生物科技集团股份有限公司提供。基础饲粮参照谷子林[4]推荐的兔营养需要进行配制，饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

2)消化能为计算值，其他营养水平为实测值

1.3 饲养试验

试验前对兔舍和笼具进行清理和消毒，采用育成兔三层阶梯式金属笼单独饲养，对每只兔笼进行单独编号，自然通风和光照，试验期间平均温度23 ℃，平均湿度55%，自由采食和饮水，每天8：00和18：00饲喂2次，投料后2 h对兔舍进行粪便清理、卫生清扫。预试期7 d，正试期28 d。预试期后空腹称重，记录初始体重，确定各组重量无显著性差异后进入正试期。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 生长性能

正式试验开始和第28天，分别称量各组试验兔的体重获得初始重和末重，计算平均日增重(ADG)，统计试验期间试验兔的采食量，计算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。统计试验期间试验兔的腹泻情况，计算获得腹泻频率，公式：腹泻频率=试验期内腹泻只日数/(试验天数×试验只数)×100%。

1.4.2 肝脏指数

试验结束后，每组挑选体重接近该组平均值试验兔6只，屠宰前称量宰前活重，屠宰后取肝脏，用眼科剪剔除脂肪和结缔组织后称量器官重，计算肝脏指数，公式：肝脏指数(g/kg)=肝脏重量(g)/宰前活重(kg)。

1.4.3 血清抗氧化指标

试期结束后，试验兔空腹12 h，每只采血3 mL，采血管呈45°斜面静置，待血清析出后4 000 r/min离心10 min，分装上清，于-80 ℃保存待测。采用生化法测定超氧化物歧化酶( SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的活性和水平，试剂盒购自北京百智生物科技有限公司，货号分别为BCEA002、BCBU-011、BCOS-009，具体操作按试剂盒说明书指示进行。

1.4.4 肝脏抗氧化性能

取试验兔肝脏，研磨后按1∶9比例与PBS缓冲液混匀，4 000 r/min离心10 min，分装上清，于-80 ℃保存待测，采用生化法测定 SOD、T-AOC和MDA的活性和水平，具体操作按试剂盒说明书指示进行。

1.4.5 肝脏微观结构

取各组试验兔肝脏左叶相同位置固定于10%福尔马林，HE染色制作石蜡切片，在光镜下观察各试验兔肝脏微观结构变化。

1.5 统计分析

试验数据采用 SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著，0.05

2 结果与分析

2.1 绿原酸对肉兔生长性能的影响

由表2可知，对照组和抗生素组间各指标差异不显著。与对照组及抗生素组相比，CGA2000组肉兔的末重分别显著提高了9.90%和9.82%(P<0.05)。与对照组相比，CGA2000组肉兔的平均日增重也显著提高了18.73%(P<0.05)。腹泻率方面，以对照组最高，绿原酸组随着添加剂量的增加有降低的趋势，抗生素组最低。

表2 绿原酸对肉兔生长性能的影响

2.2 绿原酸对肉兔肝脏指数的影响

由表3可知，各组的肝脏指数无显著差异(P>0.05)，但CGA2000组与对照组相比有上升趋势(0.05

表3 绿原酸对肉兔肝脏指数的影响 g/kg

2.3 绿原酸对肉兔血清抗氧化性能的影响

由表4可知，与对照组相比，抗生素组T-AOC的活性提高了20.00%，差异显著(P<0.05)，绿原酸组血清T-AOC、SOD活性及MDA水平均无显著差异(P>0.05)，但CGA2000组T-AOC和SOD活性较对照组均有上升的趋势(0.05

表4 绿原酸对肉兔血清抗氧化指标的影响

2.4 绿原酸对肉兔肝脏抗氧化性能的影响

由表5可知，对照组和抗生素组各指标差异不显著，CGA1000组T-AOC活性较抗生素组显著提高了20.00%(P<0.05)，其他各组内无显著性差异(P>0.05)。添加1 000～2 000 mg/kg绿原酸与对照组相比SOD和T-AOC活性均有增高趋势，MDA水平有下降趋势(0.05

表5 绿原酸对肉兔肝脏抗氧化指标的影响

2.5 绿原酸对肉兔肝脏微观结构的影响

由图2可知，对照组肝细胞形态基本正常，但有少许局部轻微纤维增生与轻微点状坏死，绿原酸组与抗生素组肝脏组织被膜完整，肝小叶分叶不明显，中央静脉内皮完整，肝索排列较规则；肝细胞形态基本正常，未见明显病理变化。

A.对照组；B.抗生素组；C.CGA500组；D.CGA1000组；E.CGA2000组

3 讨论

3.1 绿原酸对肉兔生长性能的影响

饲粮中添加CGA可以改善动物的生长性能。刘则学等[5]报道，在仔猪饲粮中添加250 g/t 的CGA，可以使仔猪的料重比显著降低，腹泻频率有降低的趋势，改善了仔猪的生长性能。Chen等[6]在断奶仔猪饲粮中添加1 000 mg/kg的CGA后发现，仔猪的饲料转化率显著提高。陈鹏等[7]在断奶仔猪饲粮中添加CGA后发现，仔猪的平均日增重显著提高，生长性能得到改善。本试验中，与对照组和抗生素组相比，GCA2000组肉兔的末重显著升高，与上述报道的结果相近。分析可能的原因是通过添加CGA改善了机体抗氧化能力，从而提高了肉兔的生长性能；同时CGA还具有抗菌、消炎以及增强免疫力等作用，对肉兔具有益生作用[8]。

3.2 绿原酸对肉兔肝脏指数的影响

本试验表明添加绿原酸有改善肝脏指数的趋势。袁俊[9]给高血糖小鼠灌服2 500 μg/g CGA后发现，脏器损伤好转，肝脏肿大恢复正常，表明CGA对小鼠的肝脏有一定的保护作用。其可能的原因是CGA具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学功能，减少了各种应激及细菌、病毒对肉兔免疫系统的影响，间接有益于肝脏的发育[10]。

3.3 绿原酸对肉兔血清抗氧化性能的影响

本试验结果表明，与对照组相比，CGA2000组肉兔血清T-AOC和SOD活性虽无显著差异但均有升高的趋势，说明CGA一定程度上增强了肉兔的抗氧化性能。刘英等[11]报道，添加300 mg/kg CGA可以使断奶仔猪血浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的活性显著升高，增加了仔猪的抗氧化性能。符运斌[12]在肉牛饲料中添加CGA后发现，肉牛血清中GSH-Px、SOD和 T-AOC的活性均显著升高，MDA含量降低，减少了热应激下肉牛的脂质过氧化损失。黄少文等[13]在母猪饲粮中添加300 mg/kg CGA后发现，母猪血清中GSH-Px和CAT分别提高了24.00%和38.56%。上述报道与本试验结果相近，但CGA对肉兔抗氧化性能的改善效果不如仔猪、母猪以及肉牛，这可能和畜种及试验处理的差异有关。CGA是一种酚型抗氧化剂，一方面其酚羟基结构能与自由基反应，使其失活，减少对机体的氧化应激；另一方面，其可以通过Keep1-Nrf2-ARE信号通路，上调其下游SOD1、CAT、GPX1、GST、GR等基因的表达，促进抗氧化酶的合成，增强机体的抗氧化能力[14]。

3.4 绿原酸对肉兔肝脏抗氧化性能的影响

肝脏是机体代谢的重要器官，本试验中，添加1 000～2 000 mg/kg CGA与对照组相比，肝脏抗氧化性有提高趋势，添加1 000 mg/kg CGA比抗生素组显著提高了T-AOC水平，对机体肝脏抗氧化能力有所改善。栗灵皓等[15]给高糖高脂大鼠饲喂绿原酸，高剂量组可显著提高肝脏SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活力，降低MDA水平，有效预防和减轻肝脏氧化损伤。Koriem等[16]研究证实CGA同分异构体5-二咖啡酰奎宁酸(5-CQA)能减轻脱氧麻黄碱导致的大鼠氧化应激反应，提高肝脏中SOD和GSH-Px水平，降低MDA含量。上述报道与本试验的结果相近，原因可能是绿原酸可通过降低血脂和肝脏脂质的积累，提高血清和肝脏清除自由基能力和抗氧化水平[17]；也可能是绿原酸通过增加肝脏脂肪酸的作用，降低胆固醇，抑制炎症反应，从而增加机体抗氧化能力[18-19]。

3.5 绿原酸对肉兔肝脏微观结构的影响

本试验中，对照组肉兔肝脏有少许局部轻微纤维增生与轻微点状坏死，而CGA组肝细胞形态基本正常，未见明显病理变化，说明CGA对肉兔的肝脏有一定的保护作用。Feng等[20]报道CGA可以通过增强小鼠的抗氧化能力和抑制炎症反应，来缓解D-半乳糖引起的小鼠肝损伤。周艳等[10]报道添加CGA可以缓解大鼠由慢性内毒素引起的肝损伤。史秀玲等[21]报道添加3.5～14 mg/kg的CGA可以缓解由CCl4引起的小鼠肝损伤。杨宏昕等[22]也发现，添加100 mg/kg的CGA可以抑制由CCl4引起小鼠肝损伤。上述报道与本试验的结果相近，其可能的原因是CGA可增强机体清除活性氧的能力和抗氧化能力，减少肝脏线粒体中的自由基，缓解肝脏脂质过氧化反应，从而发挥保肝作用[23]，此外CGA还能调节肝脏细胞葡萄糖的耐受性和胰岛素敏感性从而改善肝脏的糖异生和脂质代谢[24]，以及能通过抑制透明质酸的活性增强肝脏的抗炎和抗感染能力[25]，减少肝脏的损伤。

综上，添加绿原酸可以通过改善肉兔血清和肝脏的抗氧化能力来发挥保肝作用，改善肝脏形态结构，促进肝脏发育，从而提高肉兔生长性能，建议添加剂量为2 000 mg/kg。