基于表面等离子体共振技术筛选与转录因子AP-2γ具有高亲和力的小分子化合物

赖丹宁，张逸菲，王培鑫，林少玲，胡嘉淼＊

（1. 闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2. 福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002）

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）是一种无标记的生物分析技术，常用于检测金属/介电界面上的生物分子相互作用[1-2]。它可用于鉴定并量化分子相互作用，如蛋白质-核酸、蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子化合物等相互作用的结合亲和力[3-6]。AP-2γ转录因子属激活蛋白2转录因子家族。该家族由4个不同的成员组成，分别为AP-2α，AP-2β，AP-2γ及后来发现的AP-2δ[7]。目前研究表明，该家族所有成员都有一个独特的介导蛋白质二聚化的螺旋-环-螺旋（helix-span-helix）结构；而N端富含脯氨酸和谷氨酰胺的区域介导转录激活[8]。许多研究表明，恶性肿瘤与AP-2γ蛋白的过量表达及活性异常有关[9-12]。因此，寻找可有效抑制AP-2γ活性的小分子化合物被认为是潜在的肿瘤药物开发策略。

本文采用SPR技术筛选美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的药物分子库中，同AP-2γ蛋白存在高亲和力的小分子化合物，并测定样品间相互作用的动力学常数，以期为新型抗肿瘤药物的开发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PlexArray®HT生物分子相互作用分析仪（美国Plexera公司）。

1.2 材料

AP-2γ蛋白（DetaiBio公司，纯度>90 %）；DA1018药物芯片（美国Plexera公司），芯片上打印有FDA批准的1018种小分子化合物及阴性对照二甲亚砜（DMSO）、阳性对照雷帕霉素（rapamycin）；DMSO（北京索莱宝）；丙三醇（国药集团）；甘氨酸（北京索莱宝）；1×PBS（pH 7.4，北京索莱宝）。

2 方法

2.1 流通相及固定相的制备

选择FDA 分子库的 1018 种小分子作为固定相，由厂家预先通过3D光交联方式打印于SPR芯片表面；流通相选择AP-2γ蛋白溶液，使用前将AP-2γ蛋白原液用1×PBS（pH 7.4）及10 %丙三醇缓冲液稀释成3 个浓度梯度（5 0 0，2 5 0，1 2 5 nmol/L）。

2.2 SPR实时动力学分析

用生物分子相互作用分析仪加载打印有目标分子的芯片，随后加载不同浓度梯度（500，250，125 nmol/L）的AP-2γ蛋白样品各 650 μl，流速为2 μl/s，结合时间为300 s，解离时间为300 s。用盐酸甘氨酸（pH 2.0）溶液作为重生液。所得的3次数据通过Plexera SPRi 系统计算并获得平均值。

3 结果

3.1 系统基线建立及芯片质量验证

首先以100 nmol/L 的FK506结合蛋白12（FK506-binding protein of 12 kD）作为流通相检验芯片质量，结果见图1。由图1可知，FK506结合蛋白12与阴性对照DMSO基本无相互作用，信号基本同系统背景的基线信号相仿；而FK506结合蛋白12与已知的配体雷帕霉素（阳性对照）迅速结合产生信号，响应值迅速升高，并在约300 s后达到饱和，响应值趋于稳定。提示该芯片质量检测合格、SPR系统工作正常。

图1 阴阳性样点信号对照

3.2 FDA批准的1018种药物与AP-2γ蛋白的相互作用

通过高通量SPR技术成功地从FDA批准的1018种药物中筛选出了80种能与目标AP-2γ蛋白特异性结合的药物分子（见表2）。流通相AP-2γ蛋白溶液流过芯片过程中，与芯片上80个结合样点发生结合所生成的响应值见图2。

根据图2，截取600～700 s时间段内的响应值，分别求平均值，可得AP-2γ蛋白（500 nmol/L）与芯片上结合样点的解离稳定阶段的最大响应值（RUmax）。如图3所示，AP-2γ蛋白与S4190（辛可芬，cinchophen）相互作用的解离稳定阶段的RUmax最大，其次是S3105（那氟沙星，nadifloxacin）、S1761（舒洛芬，suprofen）和S4166 （氯磺丙脲，chlorpropamide）。

图2 500 nmol/L AP-2γ与芯片上结合样点的结合情况

图3 AP-2γ 蛋白（500 nmol/L）与芯片上的结合样点的平均最大信号

3.3 样品与AP-2γ蛋白结合情况的验证

将不同浓度的AP-2γ蛋白（500，250，125 nmol/L）流过芯片，分别测定其响应值变化曲线，见图4。由图4可见，相互作用所呈现的响应值曲线均符合结合-解离循环的特征，即SPR测定结果表明测定信号响应值均呈稳定、上升、稳定、小幅下降、稳定趋势。这是由于前100 s时，仪器管道中只有缓冲液，故信号保持稳定、平坦；100 s后仪器开始进样蛋白流通相，溶液中蛋白浓度突然上升，样点上开始逐渐结合蛋白，此时实时检测信号开始上升；流通相流通一定时间后，AP-2γ蛋白与芯片上结合样点结合至饱和状态，故实时检测信号到达峰值，曲线大致维持平稳；约300 s开始，缓冲液流通进芯片，将未结合的蛋白洗脱下来，实时检测信号变弱，检测信号开始不断下降，此为解离阶段；解离完成后，信号曲线趋于平稳[13]。此外，随着流通相浓度的增加，特异性结合信号逐渐增强。

图4 AP-2γ与样品S4190（a），S3105（b）， S1761（c）和S4166（d）的浓度梯度结合曲线

3.4 动力学数据分析

FDA批准的药物分子库中，能与AP-2γ蛋白特异性结合的小分子共有80种。通过对这80种小分子与AP-2γ蛋白的亲和力常数（KD）进行计算，可发现KD集中在10-9～10-7mol/L左右，证实测得特异性结合能力强，见表1。

表1 目标药物与AP-2γ蛋白结合的动力学、亲和力

表1（续）

进一步以10为底，对FDA批准的药物分子库样品与AP-2γ蛋白的结合常数平均结合速率常数（Avg Kon），平均解离速率常数（Avg Koff）取对数进行分析，可得结合能力动力学分布图（见图5），可见这80种小分子与AP-2γ蛋白的特异性结合绝大部分都在类型一、三区域内，结合都是稳定的。

图5 80种小分子化合物与AP-2γ蛋白的结合能力动力学分布图

4 讨论

SPR技术灵敏度高，特异性强，能实现高通量检测，并可实时监测化学生物反应过程，为抗肿瘤药物开发提供了有力的研究工具。本研究中，我们采用了SPR技术对抗肿瘤的潜在药物进行筛选。在FDA批准的1018种药物中，我们确定了80种与AP-2γ蛋白具有较高的亲和力、有可能应用于肿瘤治疗的潜在药物。其中，氯磺丙脲（chlorpropamide）对AP-2γ蛋白的亲和力最强，其次是甲溴辛托品（anisotropine methylbromide）、维生素D3 （Vitamin D3）、扎托布洛芬（zaltoprofen）、羟萘酸苄酚宁（bephenium hydroxynaphthoate）、吡硫翁锌（pyrithione zinc，PYZ）、阿西美辛（acemetacin、雷米普利（ramipril）、阿昔洛韦（acyclovir）、那氟沙星（nadifloxacin）等。

其中值得关注的如维生素D3在癌症的发病机制和过程中的重要性已通过体外研究、动物研究及流行病学研究得到证实。Amir等[14]报道乳腺癌骨转移患者每天服用10 000 IU维生素D3和1000 mg钙补剂能显著减少疼痛部位的数量。Fife等[15]发现维生素D3能显著抑制雌激素受体阴性、孕激素受体阴性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、人前列腺癌细胞系LNCaP和人骨肉瘤细胞系U2OS的体外增殖。Swami等[16]研究发现，与对照组（饲料含1000 IU/kg维生素D3）相比，在4周维生素D3补充饮食（饲料含5000 IU/kg维生素D3）后，携带MCF-7乳腺癌异种移植瘤的免疫功能受损小鼠的肿瘤显著缩小（>50 %）。Marshall等[17]研究发现每天补充4000 IU维生素D3可降低低风险前列腺癌患者重复活检阳性率。此外，在一些研究中，维生素D代谢物（25-羟基维生素D）水平较低被证实与乳腺癌预后不良有关[14]。

吡硫翁锌（pyrithione zinc，PYZ）是一种锌的配位复合物，被FDA批准为非处方局部抗菌药物，用于治疗银屑病和B波段紫外线（ultraviolet radiation B，UVB）诱导的表皮增生[18]。近年多项研究表明，PYZ在癌症干预方面具有应用潜力。Srivastava等[18]研究发现PYZ可有效降低口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞的集落形成、迁移和侵袭的能力；其机制主要涉及PYZ引起OSCC细胞中PI3K/AKT/mTOR和WNT/b-catenin等信号通路的改变，降低了14-3-3z、14-3-3s、cyclin D1、c-Myc、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2）等蛋白的表达。此外，PYZ治疗还被证实可显著减少免疫受损NOD/SCID/Crl小鼠的移植成瘤体积，而不会对正常组织造成明显的毒性。项航[19]研究发现PYZ可在胃癌细胞中通过改变溶酶体膜通透性抑制自我保护性自噬，还可抑制异种皮下移植瘤的生长。Tailler等[20]在FDA批准的1040种药物中发现PYZ和哇巴因（ouabain，OUA）是潜在的抗白血病药物，PYZ和OUA均能有效诱导急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞凋亡，诱导凋亡染色质凝聚和抑制核因子-κB存活信号（nuclear factor-κB survival signaling），导致抗凋亡蛋白表达减少。

氯磺丙脲、甲溴辛托品、扎托布洛芬等药物目前虽然还没有应用于癌症治疗的相关报导，但相比其他药物，它们具有与AP-2γ蛋白亲和力高、结合稳定等优势，仍具有很大的发展成为抗癌药物的潜力。本文从现有的已被FDA批准的1018种药物中寻找能AP-2γ蛋白特异性结合，并具有较高亲和力的药物，可有效减少研究周期，便于药物更快地服务于临床。

5 结论

综上，本文利用高通量SPR技术，从FDA批准的药物库筛选出能与AP-2γ蛋白产生特异性结合的80种小分子药物，并得到了相应的动力学常数。在后续的研究中，需对AP-2γ蛋白与目标样品的结合情况进行挑选验证，可结合解离稳定阶段的平均最大信号值RUmax及各结合样点的亲和力来挑选结合信号强、亲和力大的药物进行相关验证试验。