HPLC测定妇乐颗粒中10个成分的含量

骆海春，姚起艳，陈高健，张雪梅

（北海市食品药品检验所，广西 北海 536000）

妇乐颗粒现收载于2020年版《中华人民共和国药典》一部，是由忍冬藤、大血藤、甘草、大青叶、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟大黄10味药材加工而成的中成药，具有清热凉血，化瘀止痛之功效，临床用于瘀热蕴结所致的带下病及慢性盆腔炎等症[1]。现行标准中仅对熟大黄中的大黄酚、大黄素进行含量控制，相关文献也仅针对方中个别药材中的单一指标成分开展研究[2-4]。妇乐颗粒方中药味较多，化学成分复杂，单一指标难以全面反映药品内在质量。为更客观、全面地评价和控制妇乐颗粒质量，本研究采用高效液相色谱（HPLC）波长切换法同时测定妇乐颗粒中绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素的含量，以期为提高和完善妇乐颗粒质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT125D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；BX7200HP型超声波清洗器（济宁鲁超仪器厂）。

1.2 药品与试剂

妇乐颗粒（规格：6 g/袋；批号：20191205，20200822，20200716，20200628，20200609；湖北襄阳隆中药业集团有限公司）；芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度：95.1 %），绿原酸对照品（批号：110753-202018，纯度：96.1 %），马钱苷对照品（批号：111640-201808，纯度：99.0 %），咖啡酸对照品（批号：110885-201703，纯度：99.7 %），甘草苷对照品（批号：111610-201908，纯度：95.0 %），延胡索乙素对照品（批号：110726-201819，纯度：99.6 %），川楝素对照品（批号：111842-201804，纯度：96.9 %），甘草酸铵对照品（批号：110731-202021，纯度：96.2 %），大黄酚对照品（批号：110796-201922，纯度：99.4 %），大黄素对照品（批号：110756-201913，纯度：96.0 %，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液及混合对照品溶液的制备 取绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素对照品各适量，精密称定，加70 %甲醇，超声使溶解，制成每1 ml含绿原酸1.1150 mg、马钱苷0.2640 mg、咖啡酸0.2010 mg、甘草苷0.5488 mg、甘草酸铵0.3112 mg、大黄酚0.3034 mg、大黄素0.3616 mg、芍药苷0.8962 mg、川楝素0.1106 mg和延胡索乙素0.8204 mg的对照品储备液。

精密量取上述储备液2 ml，置100 ml量瓶中，加70 %甲醇，制成每1 ml含绿原酸22.30 μg、马钱苷5.28 μg、咖啡酸4.02 μg、甘草苷10.98 μg、甘草酸铵6.22 μg、大黄酚6.07 μg、大黄素7.23 μg、芍药苷17.92 μg、川楝素2.21 μg和延胡索乙素16.41 μg的混合对照品溶液，摇匀，过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取妇乐颗粒适量，研细，称取约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，称定重量，超声（功率：400 W，频率：50 kHz）提取50 min，放至室温，再次称定重量，用70 %甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按妇乐颗粒处方工艺制备缺忍冬藤、大血藤、甘草、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡素和熟大黄的阴性样品，按2.1.2项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件及专属性试验

色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1 %磷酸溶液（B），流速：1.0 ml/min，梯度洗脱（0～12 min，24 %A→41 %A；12～37 min，41 %A→63 %A；37～51 min，63 %A→35 %A；51～60 min，35 %A→24 %A）。检测波长：0～12 min，327 nm（绿原酸、咖啡酸）；12～38 min，237 nm（芍药苷、马钱苷、甘草苷、甘草酸铵）；38～46 min，254 nm（大黄素、大黄酚）；46～60 min，208 nm（川楝素、延胡索乙素）；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液，2.1.2项下供试品溶液和2.1.3项下阴性样品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，色谱图基线平稳，绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素与相邻色谱峰分离完全（分离度＞1.5），各待测成分的理论塔板数均＞4000，阴性样品对10个指标成分检测无干扰。色谱图见图1。

图1 专属性试验HPLC色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取2.1.1项下混合对照品储备液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 ml，置于200 ml量瓶中，加70 %甲醇定容至刻度，即得系列浓度混合对照品溶液。按2.2项色谱条件进样分析，以各待测成分的质量浓度为横坐标（X，μg/ml），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。结果绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素在一定质量浓度范围内线性关系良好。回归方程、线性范围、相关系数见表1。

表1 10种有效成分线性关系考察结果

2.3.2 精密度考察 精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液，按2.2项色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算各待测成分峰面积RSD。结果，绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素峰面积RSD分别为1.37 %，0.89 %，1.02 %，0.67 %，1.19 %，1.11 %，0.93 %，1.25 %，0.74 %，0.64 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察 取同一批妇乐颗粒（批号：20191205），按2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2项色谱条件下进样分析，记录色谱图，计算各待测成分含量及其RSD。结果绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素平均含量分别为1.1523，0.2544，0.1987，0.5412，0.3124，0.2977，0.3456，0.9176，0.0947，0.7568 mg/g，RSD分别为0.90 %，0.68 %，1.05 %，1.13 %，1.36 %，1.27 %，0.47 %，0.93 %，1.10 %，0.88 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取同一批妇乐颗粒（批号：20191205），按2.1.2项下方法制备后，分别于0，2，4，8，16，24，36，48 h，按2.2项色谱条件进样测定，记录峰面积。结果绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素峰面积的RSD分别为1.34 %，0.87 %，1.62 %，0.84 %，1.64 %，0.87 %，0.69 %、1.25 %，1.37 %，0.96 %（n=6），表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取2.3.3项下样品0.5 g，共6份，精密称定，分别置于50 ml量瓶中，精密加入2.1.1项下对照品储备液0.5 ml，再按2.1.2项下方法制备溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素加样回收率及RSD。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

表2（续）

2.3.6 耐用性考察 在相同条件下，考察不同流速（0.8，1.0，1.2 ml/min）、不同色谱柱温度（25，30，35 ℃）和不同色谱柱型号（Agilent TC-C18、Diamond C18、Waters C18，规格：250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果不同流速和柱温对10个指标成分色谱峰峰形和出峰时间影响较大（RSD＞5.0 %），故试验中应注意控制流速和色谱柱的温度；不同厂家的色谱柱对色谱峰的峰形及出峰时间影响较小（RSD＜1.0 %），各指标成分均能基线分离。

2.4 样品含量测定

取5批妇乐颗粒，分别按2.1.2项下方法制备供试品溶液。将各供试品溶液和2.1.1项下混合对照品溶液依法进样分析，记录峰面积，按外标法计算各样品中绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素的含量。结果见表3。

表3 妇乐颗粒中各待测成分的含量（n=3）

3 讨论

3.1 指标成分的选择

妇乐颗粒由忍冬藤、大血藤、甘草、大青叶、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟大黄10味药材配伍而成。方中忍冬藤、大血藤、蒲公英富含以绿原酸，咖啡酸为代表的有机酸类物质，这类物质具有抗菌，抗病毒，抗炎镇痛，抗肿瘤等功效[5-7]；方中牡丹皮和赤芍均含有以芍药苷为代表的单萜苷类物质，这类物质具有止痛、抗炎、保肝及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用[8-9]；研究表明，川楝子中的三萜类化合物具有驱虫、抗菌、抗炎、抗癌、抗乳腺增生等作用，川楝素是川楝子中含量较高的三萜类物质；醋延胡索中的延胡索乙素等生物碱类物质具有活血，行气，止痛之疗效，常用于脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后瘀阻等症[10]；甘草具有补脾益气，清热解毒，缓急止痛，调和诸药之功效，临床应用范围广[11]。熟大黄具有消肿止痛，散瘀止血之功效，妇乐颗粒现行标准是以熟大黄中蒽醌类物质大黄酚、大黄素作为活性指标进行含量控制[12]。结合2020年版中国药典一部中分别以绿原酸和马钱苷、咖啡酸、甘草苷和甘草酸铵、延胡索乙素、芍药苷、大黄酚和大黄素作为忍冬藤、蒲公英、甘草、醋延胡索、赤芍和熟大黄含量测定项下的指标成分[1]，试验以绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素作为指标成分。以多味药材中多种活性成分作为检测指标，较单味药材、单一成分可更全面、准确地评价药品内在质量。

3.2 提取方法的优化[13-14]

因待测成分较多，不同的溶媒对不同物质溶解性存在差异。试验以10种活性成分色谱峰的峰面积作为评价指标，分别考察了水、乙醇、甲醇3种溶媒对10种成分提取率的影响。发现以甲醇作为溶媒时提取较完全，但杂质峰较多，摸索不同比例的甲醇溶液，结果以70 %甲醇溶液作为溶媒，提取完全，且杂质峰较少，各色谱峰分离度均＞1.5。试验分别考察超声处理（功率：400 W，频率：50 kHz）和加热回流两种提取方式及不同提取时间对各成分溶出率的影响，结果两种提取方式均可提取完全，考虑试验易操作性，选择超声处理50min作为样品处理方式。

3.3 色谱条件的选择

试验采用二极管阵列检测器在210～400 nm范围内对对照品溶液进行光谱扫描，参考相关文献[15-16]并结合各成分出峰时间的先后顺序，最终采用波长切换法，在327 nm波长处检测绿原酸和咖啡酸，在237 nm波长处检测芍药苷、马钱苷、甘草苷和甘草酸铵，在254 nm波长处检测大黄素、大黄酚，在280 nm波长处检测川楝素、延胡索乙素。试验考察了不同流动相体系[13,15-16]，有机相甲醇的分离能力优于乙腈，在水相中加入适量的酸性物质可有效改善色谱峰拖尾现象。试验以各色谱峰的对称因子、分离度和理论塔板数为评价指标，考察了甲醇-0.1 %冰醋酸水溶液、甲醇-0.1 %甲酸水溶液和甲醇-0.1 %磷酸水溶液的分离效果。结果以甲醇-0.1 %磷酸溶液为流动相梯度洗脱时，10个活性成分色谱峰峰形最佳。

4 结论

试验建立了一种可同时测定妇乐颗粒中绿原酸、马钱苷、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵、大黄酚、大黄素、芍药苷、川楝素和延胡索乙素10个化学成分的HPLC方法，该方法操作便捷，结果准确，重复性高，可用于妇乐颗粒的质量控制。