延胡索总碱理化性质及体外经皮渗透性的研究

姜明瑞 王志成 岳珠珠 张婧秋 魏晓彤 石双慧 王梦琳 王慧楠 陈梦雨 王英姿

延胡索是中医临床理气止痛之要药，延胡索总碱是其主要药效物质基础，其中延胡索甲素、延胡索乙素及延胡索丑素是延胡索发挥镇痛作用的主要活性成分[1-2]。目前与延胡索总碱体内吸收、分布、代谢密切相关的溶解度、油水分配系数等重要理化参数研究报道较少，尚未见关于延胡索总碱体外经皮渗透性能的研究。穴位贴敷疗法是中医内病外治的一种特色疗法，药物贴敷神阙穴，预期能够发挥穴位刺激和药物疗效的双重作用[3-6]，因此，探究延胡索总碱穴位及非穴位给药的体外经皮渗透性能具有一定意义。本实验建立酸性染料比色法测定延胡索总生物碱含量，同时采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定延胡索总碱中延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的含量，考察延胡索总碱包括延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的溶解度、油水分配系数等理化常数，并研究延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素神阙穴与非穴位体外经皮渗透性能，以期为延胡索总碱经皮给药制剂研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，由斯贝福提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010，适应性喂养3天。

1.2 实验药物

延胡索饮片(山东百味堂炮制，批号：180406)，经鉴定为罂粟科植物延胡索(CorydalisRhizoma)的干燥块茎；延胡索总碱自制(批号：20200106、20200120、20200212)；延胡索甲素对照品(含量：98.0%，上海源叶生物科技有限公司，批号：Z25N8B49010)；延胡索乙素对照品(含量：99.8%，中国食品药品检定研究院，批号：110726-201819)；延胡索丑素对照品(含量：98.%，成都德思特生物技术有限公司，批号：DST200321-157)。

1.3 主要试剂与仪器

95%乙醇(北京虹湖联合化工产品有限公司)；醋酸—醋酸钠缓冲液、溴甲酚绿、三氯甲烷、三乙胺、磷酸、冰醋酸、乙酸乙酯(北京化工厂)；正辛醇(阿拉丁生化科技股份有限公司)；氮酮、薄荷油(麦克林生化科技有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；其余试剂为分析纯、水为去离子水以及纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

UltiMate 3000型HPLC，Chromeleon工作站；KH7200DB型超声清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)；756PC型UV(舜宇恒平科学仪器有限公司)；TGL-16M型高速离心机(湘仪实验室仪器有限公司)；ZD-88型恒温振荡器(天竟实验仪器厂)；TK-12D型透皮吸收扩散仪(上海锴凯科技有限公司)；T10 basic高速电动组织匀浆机(德国IKA公司)等。

1.4 酸性染料比色法测定延胡索总碱的含量

1.4.1 测定条件 精密量取待测溶液1 mL置于分液漏斗中，加pH 4.5醋酸—醋酸钠缓冲液12 mL，溴甲酚绿3 mL，三氯甲烷9 mL，振摇2分钟，室温静置1小时后取下层三氯甲烷液，用无水硫酸钠0.4 g除去残留水分，避免干扰测定。取pH 4.5醋酸—醋酸钠缓冲液1 mL按相同操作得空白对照溶液，测定吸光度[1,7]。

1.4.2 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品8 mg至50 mL容量瓶中，加醋酸—醋酸钠缓冲液溶解定容，得0.160 mg/mL的对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备 精密称取延胡索总碱2 mg，加醋酸—醋酸钠缓冲液溶解定容，即得。

1.4.4 方法学考察 (1)测定波长的确定：精密量取醋酸—醋酸钠缓冲液、对照品溶液和供试品溶液各1 mL分别置于分液漏斗中，按照“1.4.1”项下方法进行显色，于紫外—可见分光光度计上扫描(200～800 nm)，以确定最大吸收波长。结果显示，延胡索总碱溶液与延胡索乙素溶液的最大吸收均在411 nm处，且空白对照溶液在该处无此吸收，因此以411 nm作为检测波长，结果见图1。(2)线性关系考察：精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别加醋酸—醋酸钠缓冲液溶解定容至5 mL，按“1.4.1”项下方法测定吸光度，延胡索乙素的线性回归方程为Y=5.2887X-0.0474，R2=0.9994，在0.01612～0.1612 mg/mL范围内线性关系良好。(3)精密度考察：取对照品溶液，按照“1.4.1”项下方法连续进样测定6次，结果RSD为0.11%，精密度良好。(4)重复性考察：精密称取同一批延胡索总碱6份，按“1.4.3”项下方法制备延胡索总碱溶液，按照“1.4.1”项下方法进行测定，结果RSD为0.88%，重复性满足样品测定要求。(5)稳定性考察：取延胡索总碱溶液，按照“1.4.1”项下方法操作，于显色后0、10、20、40、60、120分钟进行测定，结果RSD为1.59%，表明样品在120分钟内稳定性良好。(6)加样回收试验：取已知延胡索总碱含量的延胡索总碱溶液6份，每份1 mL，分别加入等量含量相当的延胡索乙素对照品溶液，按照“1.4.3”的方法制备，按照“1.4.1”项下方法测定，平均加样回收率为100.56%，RSD为1.63%，说明该方法回收率良好。

1.4.5 延胡索总碱样品的测定 精密称取3批不同批次的延胡索总碱，按照“1.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.4.1”项下方法进行测定，计算延胡索总碱的含量，每个供试样品平行测定3次。

1.5 HPLC法测定延胡索总碱中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的含量

1.5.1 色谱条件[8]Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相甲醇-0.04 mol/L磷酸水溶液(70:30，用三乙胺调pH为6.0)；检测波长281 nm；柱温30℃；流速1 mL/分钟；进样量10 μL。

注：A 空白溶液；B 延胡索乙素对照品；C 延胡索总碱供试品。

1.5.2 对照品溶液的制备 分别精密称取延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素对照品，加甲醇超声定容至5 mL，制得浓度分别为1.8522、0.7804、0.6233 mg/mL的母液。

1.5.3 供试品溶液的制备 精密称取延胡索总碱3 mg，加甲醇超声定容至10 mL，过0.22 μm滤膜，即得。

1.5.4 延胡索总碱样品测定 取3批延胡索总碱样品，按照“1.4.3”项下制备延胡索总碱溶液，按照“1.4.1”项下方法测定峰面积并计算延胡索总碱样品中延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素3种单体成分的含量。

1.6 延胡索总碱溶解性的测定

精密称取过量的延胡索总碱，分别加入到2 mL以下10种溶媒中：PBS缓冲液(pH 5.5)、PBS缓冲液(pH 6.86)、PBS缓冲液(pH 7.2)、生理盐水、去离子水、5%乙醇的生理盐水、10%乙醇的生理盐水、20%乙醇的生理盐水、甲醇、乙酸乙酯，37℃超声溶解，得到延胡索总碱过饱和溶液，密封。于37℃的水浴中振摇48小时后，8000 r/分钟，离心20分钟，上清液稀释适当倍数，采用酸性染料比色法和HPLC法分别测定，计算延胡索总碱在各个溶媒中的饱和溶解度以及延胡索总碱饱和状态下各个溶媒中延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素的溶解度，各组均平行测定3次。

1.7 延胡索总碱油水分配系数的测定

采用经典摇瓶法测定延胡索总碱油水分配系数，以正辛醇为油相，纯水以及pH分别为5.5、6.86和7.2的磷酸盐缓冲液为水相，等体积混合，常温磁力搅拌饱和24小时后，静置2小时，将上下两层溶液分开，得到互相饱和的油相和水相。

取适量延胡索总碱分别加入用正辛醇饱和过的纯水以及pH分别为5.5、6.86和7.2的磷酸盐缓冲液5 mL，超声溶解，振摇平衡4小时后于10000 r/分钟，离心20分钟，取上清液稀释后，分别采用酸性染料比色法和HPLC法，测定初始浓度C。然后精密量取上述水相延胡索总碱溶液3 mL，分别加入预饱和的正辛醇3 mL，密封，37℃振摇48小时，静置后于10000 r/分钟，离心20分钟，取下层水溶液，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，采用酸性染料比色法及HPLC法测定浓度CW，按照公式(1)计算延胡索总碱、延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的油水分配系数，各组均平行测定3次。

1.8 延胡索总碱体外经皮渗透性能研究

1.8.1 供给液的配制 为测定延胡索总碱的稳态经皮渗透速率，所用的供给液为延胡索总碱的饱和溶液。取过量的延胡索总碱加入到pH 5.5的PBS缓冲液中，超声溶解后，加塞密闭后将此混悬液磁力搅拌10小时，试验时取出制成3组供给液：不含促透剂的饱和药物溶液；饱和药物溶液加入3%氮酮；饱和药物溶液加入3%薄荷油，各组均平行测定3次。

1.8.2 神阙穴与非穴位的定位与离体皮肤的制备 神阙穴与非穴位定位时，在大鼠腹白线上，剑突与耻骨联合上缘连线间的上2/3与下1/3的交点处为神阙穴，距离神阙穴区域约1 cm处的腹部皮肤为非穴位，尽量避开其他穴位[9]。离体皮肤的制备时，将大鼠处死，剃毛，迅速剥取神阙穴和非穴位皮肤，剔除皮下筋膜、脂肪等组织，生理盐水洗净，滤纸吸干，置于-20℃冰箱备用。试验前将鼠皮自然解冻，并确保皮肤的完整性和均匀性。

1.8.3 体外经皮渗透实验 扩散池为体积约8 mL的垂直式扩散池，接收池有效接触面积为3.14 cm2。取神阙穴和腹部非穴位鼠皮，置于供给池与接收池之间，真皮层朝向接收池，在接收池中放入磁力搅拌子并注入预热至37℃的接收液，至液面恰与真皮接触，排净气泡。将扩散池置于(37±0.2)℃的恒温水浴中，以300 r/分钟开启磁力搅拌。平衡30分钟后，取供给液2 mL加至供给池中，分别于1、2、4、6、8、12、24小时取接收液0.2 mL，并立即补充等量37℃预热的空白接收液。体外透皮结束后，用接收液洗净大鼠皮肤，滤纸吸干，剪碎，加甲醇2 mL，高速匀浆2分钟，10000 r/分钟离心10分钟，上清液以0.22 μm滤膜过滤，采用HPLC法法测定，按公式(2)计算延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的单位面积累积渗透量(Qn)、滞留量(Qm)，以Qn对时间t作图得体外经皮渗透曲线，直线部分的斜率为稳态渗透速率(JS)，增渗倍数(enhancement ratio，ER)为24小时的累积透过量(Q24)之比，样品可储存于4℃。

其中Cn和Ci分别是第n个和第i个取样点的药物浓度，V0为接收液体积(8 mL)，V为取样体积(0.2 mL)，A为有效扩散面积(3.14 cm2)。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 酸性染料比色法测定延胡索总碱的含量

采用酸性染料比色法测定自制延胡索总碱样品的质量分数，结果表明酸性染料比色法灵敏度较高，操作较简单，重现性好，适用于延胡索总生物碱的含量测定。三批延胡索总碱质量分数分别为(59.54±0.64)%、(72.57±0.73)%、(67.37±1.63)%，均大于50%，自制所得的延胡索总碱纯度较高，批间稳定性较好。

2.2 延胡索总碱中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的含量测定

3批延胡索总碱样品中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的HPLC含量测定结果为延胡索甲素(80.04±3.32)mg/g、延胡索乙素(65.46±4.52)mg/g、延胡索丑素(37.00±2.61) mg/g。结果显示延胡索总碱样品中延胡索甲素的含量最高，约为延胡索乙素含量的1.2倍，延胡索丑素含量的2.2倍。

2.3 延胡索总碱溶解性的测定

延胡索总碱在10种不同溶剂中的溶解性结果见表1，随着pH的增大，延胡索总碱在PBS缓冲液中的溶解度依次减小。延胡索总碱在生理盐水和去离子水中的溶解度相近，但不同浓度乙醇的加入能够增大其溶解度，其中延胡索总碱在含10%乙醇的生理盐水的溶解性相对更好。甲醇和乙酸乙酯对延胡索总碱的溶解度相对较低，但是对延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素3种单体成分的溶解度较高，而且两种溶剂中均为延胡索甲素>延胡索乙素>延胡索丑素，可能因为乙酸乙酯作为有机溶剂更易溶解延胡索总碱中的脂溶性生物碱，而对其它季铵类水溶性生物碱溶解性较差，从而导致对延胡索总碱整体的溶解度较小。10种溶剂除乙酸乙酯外，其余均为略溶，均满足试验所需漏槽条件，最终根据延胡索总碱溶解度选择含10%乙醇的生理盐水作为后续体外经皮渗透试验的接收介质。

2.4 延胡索总碱油水分配系数的测定

正常皮肤表面偏酸性，pH约为5.5～7.0[10]，因此以经典摇瓶法测定延胡索总碱在纯水和pH分别为5.5、6.86和7.2的磷酸盐缓冲液中的油水分配系数，实验结果见表2。延胡索总碱在纯水以及pH为5.5～7.2 PBS缓冲液中的油水分配系数值为-1

2.5 延胡索总碱体外经皮渗透性能研究

大鼠神阙穴与非穴位体外经皮渗透试验结果如图2，神阙穴给药的24小时累积渗透量高于非穴位，且3%氮酮和3%薄荷油能够明显促进延胡索总碱中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的透皮吸收，且3%薄荷油的促透效果最佳。

对经皮渗透曲线的直线部分进行回归，计算各试验组的稳态透过速率(JS)、增渗倍数(ER)，其中，试验组1至6分别为，结果见表3至表5，3种药效成分的稳态透过速率与增渗倍数的大小顺序均为神阙穴+3%薄荷油>非穴位+3%薄荷油>神阙穴+3%氮酮>非穴位+3%氮酮>神阙穴>非穴位，与非穴位组相比，神阙穴组的24小时累积透过量和稳态透过速率均增大，但差异无统计学意义(P>0.05)，而其他各组的24小时累积透过量和稳态透过速率均显著增大，差异有统计学意义(P<0.05)，神阙穴的增渗倍数为对应非穴位组增渗倍数的1～1.5倍，且神阙穴+3%薄荷油的增渗倍数最大，对延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的增渗倍数分别为9.757、 9.821、 4.126， 能够明显促进其经皮吸收，表明药物经神阙穴给药更有助于其渗透吸收。此外神阙穴的皮肤滞留量显著高于非穴位(P<0.05)，与穴位经皮给药的皮肤贮库效应相吻合，且延胡索甲素的皮肤滞留量高于乙素和丑素，推测可能与其脂溶性较高有关。综上，延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素的体外经皮渗透性能良好，3%氮酮和3%薄荷油能够促进3种药效成分的透皮吸收，且3%薄荷油促透效果更佳；神阙穴用药的累积透过量与滞留量高于非穴位皮肤，能够初步证实延胡索总碱神阙穴用药的可行性。

表1 延胡索总碱及3种单体成分在10种溶剂中的溶解性

表2 延胡索总碱及3种单体成分在不同溶剂中的油水分配系数

图2 延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素经神阙穴和非穴位皮肤的经皮渗透曲线(n=3)

表3 延胡索甲素的体外经皮渗透相关渗透参数

表4 延胡索乙素的体外经皮渗透相关渗透参数

表5 延胡索丑素的体外经皮渗透相关渗透参数

3 讨论

适宜的溶解性、油水分配性能等理化性质是药物制剂研发所需的基础信息，直接影响其剂型设计[11-13]。实验研究结果表明，延胡索总碱以及延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素在不同溶媒中的溶解性能不同，除乙酸乙酯外，延胡索总碱在其余9种溶媒中均为略溶，最终以10%乙醇生理盐水作为后续体外经皮渗透试验的接收介质。延胡索总碱在纯水以及pH为5.5～7.2 的PBS缓冲液中的油水分配系数值-1

药物的溶解性能、油水分配系数以及体外透皮吸收性能是新剂型研发中的重要理化性质参数，有助于预测药物在体内的溶解、吸收、分布与转运特点[14]。本研究建立了酸性染料比色法测定延胡索总碱样品，并将HPLC法用于延胡索甲素、延胡索乙素及延胡索丑素的含量测定，考察延胡索总碱的溶解性、油水分配系数，对延胡索总碱的成药性进行了评价，同时采用离体透皮试验，研究了延胡索总碱在神阙穴与非穴位的体外透皮与滞留差异，初步确定神阙穴用药的优势，为后续延胡索总碱作为外用经皮给药制剂的发展及其机制研究提供了实验依据和理论基础。