羚羊角水解液的氨基酸薄层鉴别与含量测定

刘妍 刘静 陈扬 赵苑伶 张雪 陈林珍 赵崇军 马志强

羚羊角为牛科动物赛加羚羊SaigatataricaLinnaeus的角，是传统名贵中药材之一，始载于《神农本草经》，在我国已有2000多年的药用历史。羚羊角性寒，味咸，归肝、心经，具有平肝息风、清肝明目、散血解毒的功效，主治肝风内动、惊痫抽搐、妊娠子痫、高热痉厥、癫痫发狂、头痛眩晕、目赤翳障、温毒发斑、痈肿疮毒[1]。羚羊角颗粒是由羚羊角水解液经加工而成的现代药物制剂，氨基酸是羚羊角的主要成分之一[2-3]。目前笔者未见国内文献用微乳液来分离鉴别动物中的氨基酸。微乳薄层色谱(microemulsion thin layer chromatography，METLC)的展开剂是微乳液，因其具有较大的增溶量和超低界面张力，能让难以分离的复杂体系和难溶化合物得以分离[4-6]，近些年来已经成功运用于生物碱[7]、黄酮[8-11]、糖类[12]、氨基酸[13]等多种化合物的分离鉴别中。为了更好地对羚羊角水解液中的氨基酸进行分析，本实验采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)—正丁醇—正己烷—水按质量比(1.5∶7.0∶1.0∶1.7)为展开剂对羚羊角水解液中的氨基酸进行定性鉴别，用异硫氰酸苯酯柱前衍生法对水解液中16种游离氨基酸进行含量测定，进一步丰富了微乳液应用于氨基酸薄层鉴别研究的方法，也为羚羊角药材的质量控制提供研究基础。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

十万分之一分析天平(Mettler Toledo公司),循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),N-1100型旋转蒸发仪,水浴锅(上海爱朗仪器有限公司),Sorvall ST 8R台式高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司),硅胶G板(100 mm×100 mm，青岛海洋化工厂分厂，批号：20181205、20190322、20190802),硅胶G板(企业A，批号：20200410),1 μL、2 μL定量点样毛细管(润泽康),双槽P-1型薄层色谱展开缸(100 mm×100 mm),DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),高效液相色谱仪(Waters 2695)包括2695四元梯度泵,自动进样器,2998 PDA检测器，在线脱气机，柱温箱，Empower色谱工作站。

1.2 实验药物

羚羊角对照药材,中国食品药品检定研究院，批号：PS210423-04；羚羊角粉(过200目筛),企业B，批号：20201011，由北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定为羚羊角粉；羚羊角水解液,实验室自制。

1.3 实验试剂

16种氨基酸对照品购自上海源叶生物科技有限公司，天冬氨酸Asp(批号：S24A8I34463，纯度≥99%)、谷氨酸Glu(批号：S27M6G1，纯度≥99%)、丝氨酸Ser(批号：S04J9I51507，纯度≥98%)、甘氨酸Gly(批号：SM0315GA14，纯度≥99%)、组氨酸His(批号：Z19A9H59384，纯度≥98%)、精氨酸Arg(批号：MKBD3032V，纯度≥98%)、苏氨酸Thr(批号：S01F4G1，纯度≥98%)、丙氨酸Ala(批号：S20A6G17672，纯度≥98%)、脯氨酸Pro(批号：S30J6G1，纯度≥99%)、酪氨酸Tyr(批号：SM0503GE13，纯度≥99%)、缬氨酸Val(批号：S06D8I49809，纯度≥98%)、甲硫氨酸Met(批号：SLBK1770V，纯度≥98%)、异亮氨酸Ile(批号：SM0503GD13，纯度≥98%)、亮氨酸Leu(批号：S10D9I76995，纯度≥98%)、苯丙氨酸Phe(批号：H20N8H48638，纯度≥98%)、赖氨酸Lys(批号：S26A8I34751，纯度≥98%)。SDS，购自湖南尔康制药股份有限公司，批号：101420181101；正丁醇、无水乙酸钠、浓盐酸、乙酸(分析纯)，均购自北京化工厂，批号依次为：20170816、20180605、20180712、20170215；乙腈、正己烷(色谱纯)，购自费希尔控制设备国际有限公司，批号依次为：190263、192565；三乙胺(分析纯)，购自上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10487468；异硫氰酸苯酯购自博纳艾杰尔，批号：BCBB1912V；茚三酮(分析纯)、乙醇(分析纯)，均购自于福晨(天津)化学试剂有限公司，批号依次为：20190402、20210108。

2 方法与结果

2.1 羚羊角水解液的薄层色谱分析

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸对照品适量，分别加入50%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%甲醇、90%甲醇制成0.3 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 对照药材、供试品溶液的制备 精密称取羚羊角对照药材及羚羊角粉(过200目筛)1.0 g置于100 mL圆底烧瓶中，第一次加入40 mL水，回流提取3小时，抽滤。第二次加入40 mL水，回流提取2小时，抽滤，合并两次滤液。剩余药渣中加入16 mL 2 mol/L硫酸溶液回流水解6小时，抽滤后，滤液中加入调成糊状的氢氧化钙，调pH值为4，沉淀24小时，抽滤得其滤液，将之与水提取滤液合并浓缩后进行60%醇沉，在4℃下沉淀24小时。抽滤，浓缩，用水定容至10 mL。再以5 000 r/分钟的转速离心20分钟得其上清液即为羚羊角水解液的供试品溶液。

2.1.3 微乳液展开剂的配制 将SDS、正丁醇、正己烷、水按质量比(1.5∶7.0∶1.0∶1.7)混匀即得含水量15%的微乳液[14-15]。

2.1.4 羚羊角水解液的薄层鉴别 参考2020版《中华人民共和国药典(四部)》通则0502[16]，吸取天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸对照品溶液各2 μL，吸取供试品溶液及对照药材溶液0.5 μL分别点于事先在110℃活化半小时的同一硅胶G薄层板上，以含水量为15%的微乳液上行展开，展距为8 cm时将薄层板取出，晾干，喷以2%茚三酮乙醇溶液，在105℃烘至斑点显色清晰。

自制8批羚羊角水解液的薄层图谱见图1。羚羊角水解液除与对照品色谱相应位置上显集中且圆的斑点外，与对照药材所示色谱条带一致，分离效果佳，天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸的Rf值依次为0.20、0.14、0.50、0.61、0.33。

2.2 羚羊角水解液的薄层耐用性考察

2.2.1 不同薄层板的分离效果考察 取供试品溶液、对照品溶液按2.1.4项下方法点于不同厂家薄层板(企业A、青岛海洋化工厂分厂)及同一厂家不同批号薄层板(青岛海洋化工厂分厂，批号：20181205、20190322、20190802)，见图2。青岛海洋化工厂分厂所制薄板分离效果要优于企业A。

2.2.2 不同温度的分离效果考察 取供试品溶液、对照品溶液按2.1.4项下方法点于同一批号薄层板，分别置于4℃与30℃的环境下展开，见图3。羚羊角水解液的色谱图在4℃与30℃下大致一致。

注：1 天冬氨酸；2 谷氨酸；3 缬氨酸；4 亮氨酸；5 赖氨酸；6～8 自制3批羚羊角水解液。A：企业A；B、C、D：青岛海洋化工厂分厂，B：批号为20181205，C：批号为20190322，D：批号为20190802。

注：1 天冬氨酸；2 谷氨酸；3 缬氨酸；4 亮氨酸；5 赖氨酸；6～8 自制3批羚羊角水解液。A:温度4℃;B:温度30℃。

2.2.3 不同湿度的分离效果考察 取供试品溶液、对照品溶液按2.1.4项下方法点于同一批号薄层板，分别置于相对湿度为32%、58%、88%的环境下展开，结果见图4。羚羊角水解液的色谱图在相对湿度32%、58%、88%环境下基本相同。

注：1 天冬氨酸；2 谷氨酸；3 缬氨酸；4 亮氨酸；5 赖氨酸；6～8 自制3批羚羊角水解液。A:相对湿度32%；B:相对湿度58%；C:相对湿度88%。

2.2.4 不同点样量的分离效果考察 取供试品溶液、对照品溶液按2.1.4项下方法点于同一薄层板上，供试品点样量由左往右依次为0.5 μL、1 μL、1.5 μL，结果见图5。羚羊角水解液最佳点样量为0.5 μL，其次为1 μL，当点样量为1.5 μL时拖尾明显。

注：1 天冬氨酸；2 谷氨酸；3 缬氨酸；4 亮氨酸；5 赖氨酸；6～8点样量依次为0.5 μL、1 μL、1.5 μL。

2.2.5 不同含水量微乳液的分离效果考察 取供试品溶液、对照品溶液按2.1.4项下方法点于同一批号薄层板上，在固定SDS、正丁醇、正己烷质量比为1.5∶7.0∶1.0的配比下，分别用含水量为10%、13%、15%、17%、20%的微乳液展开，结果见图6。各含水量图谱基本一致。

注：1 天冬氨酸；2 谷氨酸；3 缬氨酸；4 亮氨酸；5 赖氨酸；6～8 自制3批羚羊角水解液。A：含水量10%；B：含水量13%；C：含水量15%；D：含水量17%；E：含水量20%。

2.3 羚羊角水解液中游离氨基酸的分析

2.3.1 色谱分析条件 Venusil AA氨基酸分析专用柱(博纳艾杰尔，4.6×250 mm，5μm)，柱温40℃，样品室温度为4℃，流速1.0 mL/分，检测波长254 nm，一次进样量10 μL。流动相A：0.1 mol/L乙酸钠(pH 6.5)—乙腈(93∶7)，流动相B为80%乙腈，梯度洗脱：0分钟：0% B；14分钟：9.5% B；22分钟：19.5% B；37分钟：30.6% B；41分钟：31.6% B；42分钟：34.0% B。

2.3.2 衍生化溶液的制备 三乙胺乙腈溶液：将1.4 mL的三乙胺加入到8.6 mL的乙腈中混匀即得；异硫氰酸苯酯乙腈溶液：将25 μL的异硫氰酸苯酯加入到2 mL乙腈中混匀即可。

2.3.3 混合对照品溶液的配制 分别称取天冬氨酸 33.28 mg、谷氨酸36.78 mg、丝氨酸 26.31 mg、甘氨酸18.70 mg、组氨酸 38.81 mg、精氨酸 43.56 mg、苏氨酸29.76 mg、丙氨酸 22.23 mg、脯氨酸28.82 mg、酪氨酸 45.26 mg、缬氨酸 29.24 mg、甲硫氨酸 37.33 mg、异亮氨酸32.75 mg、亮氨酸 32.86 mg、苯丙氨酸 41.29 mg、赖氨酸 36.50 mg，加入0.1 mol/L盐酸溶液超声溶解并定容至100 mL。

2.3.4 供试品溶液的制备 称取5 g羚羊角粉末(过200目筛)，第一次加入200 mL水回流提取3小时，抽滤；第二次加入200 mL水回流提取2小时，抽滤。滤渣用80 mL 2 mol/L的硫酸溶液回流水解6小时，抽滤后用调成糊状的氢氧化钙调至pH值为4，沉淀24小时，滤过后将酸水解滤液与水提取滤液合并浓缩进行60%醇沉，4℃沉淀24小时。滤过后回收乙醇定容至20 mL，即得羚羊角水解液，5000 r/min离心20分钟。精密吸取离心后的上清液2 mL，加入6 mL乙腈，摇匀过滤，用乙腈—水溶液(3∶1)清洗沉淀，旋转蒸发浓缩至干，用0.1 mol/L盐酸定容至5 mL。

2.3.5 标准品与供试品的衍生 精密吸取200 μL 0.1 mol/L盐酸溶液、氨基酸混合对照品溶液及供试品溶液于1.5 mL离心管中，加入100 μL三乙胺乙腈溶液和100 μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，于室温下放置1小时。接着加入400 μL正己烷，振摇后放置10分钟，取下层溶液，过0.22 μm滤膜，取滤液200 μL，加800 μL纯净水稀释，摇匀制得空白衍生化溶液、氨基酸对照衍生化溶液和供试品衍生化溶液。图谱如图7所示。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密称取对照品天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸适量，用0.1 mol/L盐酸溶液逐级稀释，将对照品溶液配制成0.0125 μmol/mL、0.0625 μmol/mL、0.125 μmol/mL、0.25 μmol/mL、0.625 μmol/mL、1.25 μmol/mL、2.5 μmol/mL；精密称取对照品甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸适量，用0.1 mol/L盐酸溶液逐级稀释，将对照品溶液配制成0.0069 μmol/mL、0.0625 μmol/mL、0.125 μmol/mL、0.25 μmol/mL、0.625 μmol/mL、1.25 μmol/mL、2.5 μmol/mL。按2.3.5项下分别衍生化，再按2.3.1项下色谱条件进样。以各氨基酸的浓度(μmol/mL)为横坐标，相应色谱峰峰面积为纵坐标制作线性回归方程。回归方程具体见表1。

2.4.2 检测限和定量限 将氨基酸对照品溶液依次稀释衍生进样，分别以16种氨基酸的信噪比为3∶1和10∶1时确定检测限和定量限，具体见表1。

注：1 天冬氨酸；2 谷氨酸；3 丝氨酸；4 甘氨酸；5 组氨酸；6 精氨酸；7 苏氨酸；8 丙氨酸；9 脯氨酸；10 酪氨酸；11 缬氨酸；12 甲硫氨酸；13 异亮氨酸；14 亮氨酸；15 苯丙氨酸；16 赖氨酸。A 空白衍生化溶液；B 氨基酸对照衍生化溶液；C 供试品衍生化溶液。

表1 16种氨基酸的相关参数

2.4.3 精密度试验 将同一瓶供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件连续进样6次，记录各氨基酸的峰面积。羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.75%～2.28%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 将供试品衍生化溶液于制备后0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时进样分析，结果显示羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的RSD为0.72%～2.72%，这表明供试品衍生化溶液在4℃、24小时内稳定。

2.4.5 重复性试验 取同一批次水解液平行制样6份，测定氨基酸的峰面积，羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的RSD为0.81%～2.59%，说明此法重复性良好。

2.4.6 回收率试验 取6份同一批已测定含量的羚羊角水解液的上清液1 mL，加入3 mL乙腈，摇匀过滤，用乙腈∶水溶液(3∶1)清洗沉淀，旋转蒸发浓缩至干，加入与之含量相近的氨基酸混合对照品，用0.1 mol/L盐酸定容至5 mL。羚羊角水解液中16种游离氨基酸的平均回收率(n=6)在96.70%～103.02%之间，RSD均<3%，符合要求。

2.4.7 样品含量测定 将自制的8批羚羊角水解液按“2.3.4、2.3.5”项下制样衍生，随后按“2.3.1”项下色谱条件进样，记录各氨基酸的峰面积，代入相应氨基酸的线性方程计算各氨基酸含量，结果以羚羊角药材与水解液体积比例为1∶1时表示，具体见表2。

3 讨论

用含水量15%的微乳液即SDS—正丁醇—正己烷—水按质量比(1.5∶7.0∶1.0∶1.7)进行配比用于薄层色谱展开时，用恰当适宜的点样量，即便温度、相对湿度发生变化，羚羊角水解液中的天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸这5种氨基酸均能实现良好分离，说明所建立的微乳薄层方法可以应对全国各地不同气候对结果的影响。羚羊角水解液中游离氨基酸含缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸这7种人体必需氨基酸，也含有对婴儿而言所必需的组氨酸，此外亦有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸。曾对液相流速(0.6 mL/分钟、0.8 mL/分钟、1.0 mL/分钟)及温度(30℃、35℃、40℃)进行考察，发现流速为0.6 mL/分钟时，4号峰甘氨酸与5号峰组氨酸不能完全分离，而流速0.8 mL/分钟能使甘氨酸与组氨酸的色谱峰完全分开但较流速为1.0 mL/分钟耗费的时间长。固定流速为1.0 mL/分钟考察温度，温度为30℃时，发现8号峰丙氨酸与9号峰脯氨酸无法分离，35℃时这两个色谱峰可以分离，由于在其他条件一定时，柱温上升会使容量因子变小，使色谱峰流出加快，综合考虑在保证分离度的前提下，为省时选择流速为1.0 mL/分钟、柱温为40℃。本次实验没有考察微乳液中表面活性剂、助表面活性剂、油相的种类与占比对羚羊角水解液的薄层色谱图的影响，期待后续研究能完善这部分。

表2 羚羊角水解液中游离氨基酸的含量(mg/mL)

笔者也曾用经典的正丁醇—冰醋酸—水即“BAW系统”进行展开，无论怎样调试比例亦或是增加甲醇、丙酮、二氯甲烷使展开系统变成五元乃至六元皆无法让羚羊角水解液中的5种氨基酸获得良好分离，而采用W/O型微乳液作为展开剂却能达到分离的目的，这可能是因为微乳色谱中，溶质在固定相、油或水连续相及内核和介面膜等数相之间进行分配，层析过程是集吸附、分配、静电、疏水、立体、萃取与反萃取等多效应于一体，从而使各物质迁移速率不同而使Rf值有差异[17-20]。与传统薄层色谱相较，微乳薄层色谱有分离效果显著提高、分离的成分增多、斑点圆而集中、重现性好、点样量少等优势[21-22]，在中药有效成分的分析应用中也越来越广泛。笔者将微乳薄层色谱应用于羚羊角水解液的氨基酸分离鉴别中，进一步丰富了W/O型微乳用于氨基酸薄层分离分析的研究，亦为羚羊角药材的质量控制提供科学依据。