NB-UVB对黑素细胞黑素合成相关基因表达的影响

孙晶莹 封 青 李 研 霍雪萍 孙丽君

陕西省人民医院中心实验室，陕西西安，710068

白癜风是皮肤黑素脱失后白斑为主要表现的皮肤性疾病，目前该疾病发病机制尚不明确，但该疾病和人体自身免疫力及遗传因素有一定关系[1,2]。导致白癜风的主要原因是人体黑素细胞遭到破坏，细胞中黑素颗粒不断减少，进而引起皮肤斑片状色素脱失。近年来的研究表明，窄谱中波紫外线(narrow bound ultraviolet B light, NB-UVB)在临床上治疗白癜风具有较好疗效，其可促进黑素细胞黑素的合成和增加酪氨酸酶活性，从而有效缓解白癜风症状[3-5]，但其具体机制仍不清楚。

本研究使用上海西格玛公司生产的SS型紫外线光疗仪，波长为311～313 nm，该波段的紫外线光毒性小，色素恢复较一致，色差小，疗效好。用此光疗仪作用黑素细胞，研究不同剂量的紫外线照射对黑素细胞的细胞活性、黑素含量以及黑素合成相关基因表达的影响，探讨NB-UVB对黑素合成的影响及在白癜风复色中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 人来源的传代稳定的黑素细胞系PIG1，由芝加哥洛约拉大学Caroline Le Poole教授惠赠。黑素细胞基础培养基Medium 254及培养基添加剂HMGS-2 均购自Gibco公司; 胎牛血清购于Hyclone 公司; RNA 提取试剂盒购自AG公司;反转录试剂盒 PrimeScript RT reagent kit、荧光PCR酶SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit均购自TaKaRa公司，引物由上海生工合成; Tyr、Tyrp2、GPNMB、MART-1抗体均购于Abcam公司，Syntenin抗体购自proteintech，β-actin、HRP羊抗鼠、HRP羊抗兔购于康为试剂，NC膜购自Pall Corporation公司。

1.1.2 实验仪器 CO2培养箱购于Heraeus公司; 核酸测定仪Nanodrop2000c和冷冻高速离心机均购于Thermo Scientific公司;倒置荧光显微镜购于Olympus公司;荧光PCR仪7500 购于ABI公司;电泳仪和转膜仪购于BIO-RAD，凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech，紫外光疗仪SS-03B型光疗仪(上海希格玛高技术有限公司，波长311 nm)。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞的培养 液氮罐中冻存的PIG1细胞37℃复苏，待完全融化后1200 rpm离心5 min，在超净工作台中弃掉冻存液上清，将细胞重悬于含8%胎牛血清及HMGS-2因子的M254培养基中，37℃，5% CO2条件下培养，细胞贴壁后更换培养基继续培养。

1.2.2 UVB照射 将PIG1细胞按每皿6×105/mL的量接种于直径35 mm细胞培养皿上，于37℃，5%细胞培养箱培养24 h；弃去培养液，1×PBS洗涤1次，加入少量1×PBS，采用紫外线光疗仪以不同的时间照射PIG1细胞，照射时间以及对应的辐照剂量见表1，照射完毕后弃掉PBS，加入2 mL完全培养基继续培养，设置未照射组用于对照。

表1 不同照射时间对应的辐照剂量

1.2.3 MTT法检测细胞活力的变化 收集对数生长期细胞，制成细胞悬液，按细胞浓度2×103个/孔接种细胞于96孔板，培养过夜后，分别以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)不同UVB剂量照射处理细胞，每组设3个复孔，24 h后每孔加入20 μL MTT溶液，37℃孵育4 h；去除上清后每孔加入100 μL DMSO溶解细胞，用酶标仪检测490 nm处的吸光度(A)值。

1.2.4 NaOH裂解法测定黑素含量 根据1.2.3中筛选的紫外线照射剂量，选择400、800、1200 mJ/cm2剂量进行照射。黑素含量的测定：UVB相应剂量处理细胞48 h后，0.25%胰酶消化，离心后去上清，PBS清洗两次，用PBS重悬后细胞计数，每个管中加入200 μL浓度为1M NaOH(含100 g/L的DMSO)，80℃水浴锅作用2 h，利用酶标仪检测A475的吸光值。

1.2.5 RT-PCR方法检测黑素合成相关基因的表达 将处于对数生长期的黑素细胞消化重悬至6孔板内培养过夜，初始细胞数为3×105个/孔。UVB 1200 mJ/cm2剂量处理细胞，分别于24 h后收集细胞，采用RNA抽提试剂盒提取总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以上述cDNA为模板，扩增Tyr、Tyrp1、Tyrp2、OA1、MART-1、Pmel17、VAT-1、OCSP、syntenin、CHCHD3、flotillin-1、GPNMB 12个黑素合成相关基因以及内参β-actin基因，计算各个基因的相对表达量。引物由上海生工生物技术公司合成，序列见表2。

表2 引物序列表

1.2.6 Western blot方法检测黑素合成相关蛋白的表达 将处于对数生长期的黑素细胞消化重悬至6孔板内培养过夜，初始细胞数为3×105个/孔。UVB 1200 mJ/cm2剂量处理细胞，于48 h后收集细胞，细胞裂解液(含RIPA)提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，加入2×上样缓冲液混合加热变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后，将蛋白从凝胶上转至NC膜上，200 mA 2 h湿转，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃摇床振荡过夜孵育一抗，PBST洗3次，5 min/次，室温孵育二抗45 min，PBST洗3次，5 min/次，凝胶成像分析系统分析目的条带。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫外线照射不同剂量对细胞活性的影响 培养黑素细胞，分别以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)的不同UVB照射剂量处理细胞，24 h后MTT检测细胞活力的变化。结果显示400、800和1200 mJ/cm2三组照射剂量对细胞活力影响不大，可以作为后续实验的选择，而辐射强度>1200 mJ/cm2时，细胞活性明显下降(图1)。

图1 紫外线照射不同剂量对细胞活性的影响

2.2 紫外线照射对黑素合成的影响 分别选择400、800、1200 mJ/cm2三个不同的紫外照射剂量处理PIGI细胞，48 h后检测不同处理组的黑素含量，结果显示随着照射剂量的增加，黑素含量增加，与对照组相比，800、1200 mJ/cm2照射剂量的细胞黑素含量明显升高，表明紫外线照射增加了黑素合成(图2)。

2.3 紫外线照射对黑素合成相关基因的影响 选择UVB剂量1200 mJ/cm2处理黑素细胞，24 h后收细胞，RT-PCR检测12种黑素合成相关基因的表达。结果显示，紫外线照射后，tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB这五种基因的表达显著升高，有显著差异(P<0.05)，见图3。

(*表示与对照组相比，P<0.05)

图3 紫外线照射对黑素合成相关基因表达的影响(*P<0.05) 图4 紫外线照射对黑素合成相关蛋白表达的影响

2.4 紫外线照射对黑素合成相关蛋白的影响 根据2.3的RT-PCR检测结果， western blot检测tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB蛋白的表达情况，结果显示，紫外线照射48 h后，tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

黑素细胞是位于表皮基底层(皮肤的最外层)的特化细胞[6]，其新陈代谢是一个精确调控的生物学行为，受到外环境(紫外线等)和内环境(细胞间相互作用等)的共同影响[7]。黑素的合成在黑素细胞内进行，黑素细胞上有光受体，紫外线照射能引起黑素细胞的黑素合成，因此当皮肤受到紫外线照射或体内激素发生变化时，局部皮肤黑素细胞产生的黑素量增加，从而在皮肤上发生色素沉着。

目前已知有12种蛋白质被认为是黑素体特异性蛋白，分别是Tyr(tyrosinase)、Tyrp1(tyrosinase-related protein 1)、Tyrp2(tyrosinase-related protein 2)、OA1(ocular albinism type 1 protein)、MART-1、gp100/Pmel17、VAT-1(vesicle amine transport protein 1 homolog)、OCSP(oculospanin)、syntenin、FLJ20420或称CHCHD3、flotillin-1/2和GPNMB (Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b)[8]。这些黑素体特异蛋白按照其特性及功能大致可以分为三大类：酶组分、结构组分和未知组分。Tyr、Tyrp1和Tyrp2是黑素形成中具有关键作用的酶组分，其在黑素合成中的功能已较为清楚，而在黑素体结构蛋白中，Pmel17是迄今为止唯一被证明参与黑素体中纤维状结构形成的蛋白[9]。GPNMB也是一种黑素小体特异性结构蛋白，它与Pmel17/gp100在结构上高度相似，在各个时期的黑素小体中都有表达[10,11]。

本研究以这12种黑素体蛋白为检测对象，明确紫外线照射对这12种黑素体蛋白表达的影响，结果发现紫外线照射细胞后，RT-PCR方法检测到Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB这5种蛋白的基因表达明显升高，western blot检测结果进一步证实了Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表达升高。Tyr、Tyrp2被UVB上调的结果已经在很多既往研究里面被证实[12]；另外张萍研究发现GPNMB也可以被UVB上调[13]；syntenin和MART-1被上调的现象在我们的研究中首次被报道。同时我们发现GPNMB和Pmel17虽同为黑素体的结构蛋白且氨基酸序列高度同源，UVB照射极大的促进GPNMB基因的表达，但是对Pmel17基因的影响并不明显，分析原因可能是由于Pmel17的PKD结构域和 RPT结构域的独特性导致UVB对两者产生不同的变化。MART-1蛋白是黑素体成熟所必需的，Syntenin蛋白对黑素合成的影响在我们之前的研究中也已经明确[14]，UVB对这两种蛋白表达的上调也进一步验证了其在黑素合成中的重要作用。

紫外线照射可以造成色素沉着，但是过量的紫外线又会损伤黑素细胞，影响细胞活性。本研究发现辐射强度>1200 mJ/cm2UVB时，细胞活性明显下降。本研究为UVB治疗白癜风时照射剂量的选择及白癜风复色的机制探讨提供了依据。