Gsk-3β、CD82和Axin1在乳房和乳房外Paget病中的表达

魏丽萍 周文文 王皓敏 张士发

1锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁沈阳，110016；2大连医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁沈阳，110016；3东北国际医院皮肤科，辽宁沈阳，110623

Paget病(Paget’s disease)又称为湿疹样癌(eczematoid carcinoma)，是一种少见的皮损表现为湿疹样外观的低度恶性表皮内腺癌，其组织病理特点是在表皮内发现Paget细胞，临床上可分为乳房Paget病(mammary Paget’s disease，MPD)和乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease，EMPD)。Gsk-3β可以调节多种类型肿瘤细胞的代谢、增殖与凋亡，对肿瘤的发生具有双重调节作用。CD82具有抑制肿瘤转移的作用。Axin1发挥抑制肿瘤的功能。目前Gsk-3β、CD82和Axin1已被证明参与乳腺癌、恶性黑素细胞瘤、皮肤鳞癌等多种肿瘤的发生与发展，但其在MPD和EMPD中的作用国内外尚未有报道，为探究其在MPD和EMPD中的作用，本研究通过免疫组化方法检测Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中的表达情况，分析其相关性，从而探讨它们在MPD和EMPD发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集北部战区总医院皮肤科2007年4月至2019年8月病理诊断为MPD和EMPD患者的蜡块和病历资料各20例，并且患者确诊前均未行放疗或化疗治疗。另收集本科室就诊的良性皮肤病患者的正常皮肤组织蜡块10例为对照组。

1.2 主要试剂 兔抗人Gsk-3β单抗(bs-0028R)、兔抗人CD82单抗(bs-1470R)、兔抗人Axin1单抗(bs-2439R)、免疫组化染色试剂盒(SP-0023)、DAB 试剂盒(CO2-04001)均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色 石蜡块切片(5 μm厚)、烤片、脱蜡、水化，高压修复抗原(100×柠檬酸钠修复液与蒸馏水按照1∶100稀释，高压锅上汽后修复4 min)，按免疫组化染色试剂盒操作说明书进行染色(PAP笔在组织片周围2～3 mm画一闭合圆圈，滴加3%H2O2，37℃孵育20 min，PBS液洗5 min×3次，滴加试剂A，37℃孵育20 min，倾去，勿洗，滴加1∶500稀释一抗，4℃过夜，37℃复温1 h，PBS液洗5 min×3次，滴加试剂B，37℃孵育20 min，PBS 液洗5 min×3次，滴加试剂C，37℃孵育20 min，PBS 液洗5 min×3次)，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。PBS液作阴性对照。

1.4 结果判定 由我科两位经验丰富的皮肤病理医师采用双盲法镜检阅片，每张切片在显微镜下随机选取5个视野，放大400倍观察评估。在细胞质或细胞膜呈黄色或棕色颗粒状沉积视为阳性染色。染色强度评分：无染色计0分，弱染色(淡黄色)计1分，中度染色(棕黄色)计2分，强染色(棕褐色)计3分。阳性细胞百分比评分：<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。免疫组化评分=阳性细胞百分比×染色强度积分。0～4分为阴性或低表达，5～8分为中度表达，9～12分为高表达[1]。

2 结果

2.1 Gsk-3β在MPD、EMPD及正常皮肤组织中的表达 三组间的表达差异具有统计学意义(P<0.001)，但MPD与EMPD相比差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 CD82在MPD、EMPD及正常皮肤组织中的表达 三组间的表达差异具有统计学意义(P<0.001)，且MPD与EMPD相比差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 Axin1在MPD、EMPD及正常皮肤组织中的表达 三组间的表达差异具有统计学意义(P<0.001)，但MPD与EMPD相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1。

表1 Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD、EMPD及正常皮肤组织中的表达

2.4 Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD中表达的相关性 Gsk-3β和CD82在MPD中的表达无相关性(r=-0.291，P=0.212)，Gsk-3β和Axin1在MPD中的表达无相关性(r=0.236，P=0.316)。CD82和Axin1在MPD中的表达无相关性(r=0.039，P=0.869)。

2.5 Gsk-3β、CD82和Axin1在EMPD中表达的相关性 Gsk-3β和CD82在EMPD中的表达无相关性(r=0.261，P=0.266)，Gsk-3β和Axin1在EMPD中的表达无相关性(r=0.392，P=0.088)。CD82和Axin1在EMPD中的表达无相关性(r=0.362，P=0.117)。

1a: Gsk-3β在MPD中低表达；1b: Gsk-3β在EMPD中低表达；1c: Gsk-3β在正常皮肤组织中中度表达；1d：CD82在MPD中中度表达；1e：CD82在EMPD中低表达；1f：CD82在正常皮肤组织中高表达；1g：Axin1在MPD中低表达；1h：Axin1在EMPD中低表达；1i：Axin1在正常皮肤组织中中度表达；1a～1i均主要表达于细胞胞质、胞膜

3 讨论

Gsk-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过调控Wnt/β-catenin、PI3K/PTEN/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK、Hedgehog、Notch、NF-κB等通路，参与细胞代谢、增殖、分化、凋亡等多种细胞过程[2]。有报道在近端胃癌患者中，Gsk-3β阳性表达明显低于胃正常组织，且Gsk-3β阳性表达的降低与胃癌的分期、分化、浸润及淋巴转移呈明显负相关，其在近端胃癌的发生、发展、浸润及淋巴转移等方面起到重要的抑制作用[3]。在神经胶质瘤中，Gsk-3β过表达可抑制Wnt/β-catenin和mTOR/p70S6K1信号通路，使HIF-1和VEGF低表达，抑制了肿瘤的血管生成及生长，从而抑制了神经胶质瘤的进展[4]。在鼻咽癌中，Gsk-3β失活可增加EZH2蛋白的稳定，导致EZH2过度表达，促进肿瘤迁移和增强其侵袭能力，从而促进鼻咽癌的发生、发展，可能是鼻咽癌治疗的未来潜在靶标[5]。本研究首次发现Gsk-3β在MPD、EMPD中的表达显著低于正常皮肤组织，三者表达强度具有显著性差异，且MPD与EMPD相比差异无统计学意义(P<0.05)，Gsk-3β在MPD、EMPD中的低表达，与上述相关研究结果一致[3-5]，提示Gsk-3β可能通过同种信号通路对乳房和乳房外Paget病的发生及发展起抑制作用。Gsk-3β在上述癌症中的低表达对肿瘤的发生、发展起促进作用，因此Gsk-3β可能为肿瘤的诊断、进展及治疗提供新的作用靶点和思路。

CD82是KAI1编码的能抑制肿瘤转移的细胞膜糖蛋白，可与其他四跨膜蛋白、非四跨膜蛋白形成四跨膜蛋白网络发挥生理功能，影响肿瘤细胞的增殖、黏附、运动和侵袭，诱导细胞凋亡和衰老[6]。研究发现在乳腺癌患者中，KAI1/CD82阳性表达显著低于乳腺正常组织，且CD82表达强度与乳腺癌分期、淋巴结转移呈负相关，其在乳腺癌的发生、发展及转移等方面有重要的抑制作用[7]。在子宫内膜癌患者中，CD82阳性表达显著低于正常子宫内膜组织，且表达强度与子宫内膜癌的分期、分化、浸润程度及淋巴结转移呈明显负相关，CD82的低表达促进了肿瘤的发生、发展和转移，其表达异常可协助判断肿瘤转移、评估预后和指导治疗[8]。本研究首次发现CD82在EMPD中的表达低于MPD，且两者显著低于正常皮肤组织，三组间的表达差异均有统计学意义，MPD与EMPD相比差异有统计学意义(P<0.05)，CD82在MPD和EMPD中的低表达，与已有研究结果一致[7，8]，提示CD82可能通过不同信号通路对乳房和乳房外Paget病的发病过程起抑制作用。CD82的低表达或下调与许多恶性肿瘤的不良预后密切相关，因此CD82可作为预测肿瘤患者疾病进展及预后的参考。

Axin1是一种包含多结构域的支架蛋白，可以与多种不同的蛋白质复合物结合，参与Wnt、p53、TGF-β、PI3K/AKT/mTOR和JNK/SAPK等多种信号通路，从而抑制肿瘤的发生和发展，是一种肿瘤抑制因子[9]。据报道在肝癌组织中，Axin1低表达与miR-650的高表达呈负相关，Axin1的过表达显著抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，而用miR650处理后则消除了Axin1对肿瘤的抑制能力，因此Axin1和miR-650可以协助肿瘤的早期诊断、治疗和预后[10]。在肺癌中，野生型Zbed3与Axin结合，可通过抑制Axin/TPC/GSK-3β复合物的降解来上调β-catenin表达和Wnt信号活性来促进肺癌增殖和侵袭，而在缺少Axin结合位点的Zbed3突变体中却未能增强β-catenin的表达，其过程依赖Axin[11]。本研究首次发现，Axin1在MPD、EMPD中的表达显著低于正常皮肤组织，三者表达强度具有显著性差异，且MPD与EMPD相比差异无统计学意义(P>0.05)，Axin1在MPD、EMPD中的低表达，与现有研究结果一致[10，11]，提示Axin1可能通过同种信号通路对乳房外和乳房Paget病的发病过程发挥抑制作用。Axin1是肿瘤发生和进展的抑制因子，稳定或上调Axin1的表达可抑制肿瘤的增殖和侵袭，可成为肿瘤治疗的潜在靶点。

既往未见Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中表达相关性的研究。本研究发现，Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中的表达并无协同作用，虽然Axin1和Gsk-3β均可通过经典的Wnt/β-catenin信号通路影响肿瘤的发生、发展[3，9]，而CD82可以减少β-catenin的磷酸化和核内聚集，对Wnt/β-catenin信号通路有抑制作用[6]，但Gsk-3β还可通过Ras/Raf/MEK/ERK、Hedgehog、Notch、NF-κB等信号通路对肿瘤产生影响，Axin1也可通过与Gsk-3β不同的信号通路发挥抑制肿瘤的作用，如p53、TGF-β、PI3K/AKT/mTOR和JNK/SAPK等信号通路，至于它们的表达调控是否有相互作用及其机理还有待进一步研究。