风诃止咳颗粒的质量标准研究

任晓蕾，庄岩，刘华石，霍金海（黑龙江省中医药科学院中药研究所，哈尔滨 150036）

风诃止咳颗粒为本院独立自主知识产权的中药产品，以本院临床使用多年的治疗咳喘的医院制剂为基础，由防风、诃子、栀子、山楂、甘草等8 味中药组成，具有止咳、平喘、化痰、利咽之功效，对痰内伏于肺引起的咳嗽、咳吐不利、痰黏难出、呼吸急促、喉间哮鸣、咽痛等症状均有显著疗效。为了对制剂质量进行控制，本研究建立风诃止咳颗粒质量标准，采用薄层色谱法（TLC）对制剂中诃子、栀子、山楂、甘草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定制剂防风药材中升麻苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素的含量，提高原制剂质量标准，为开发治疗咽痛咳喘的中药新药风诃止咳颗粒奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪、Waters 2489 型紫外检测器（美国沃特世），KQ-300DB 超声清洗机（昆山超声仪器有限公司），BP211D 型电子天平（德国Sartorius 公司），HWS26 型水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试药

甘草对照药材（批号：120904-201519，中国食品药品检定研究院）；诃子（批号：DZYC-K-003）、山楂（批号：DZYC-S-022）对照药材（成都彼斯特生物科技有限公司）；甘草苷（批号：G-009-161230）、栀子苷（批号：RFS-Z00311802022）、升麻苷（批号：S-004-150421）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号：J-002-150420）、升麻素（批号：S-007-150421）、亥茅酚苷（批号：H-027-150915）、花椒毒素（批号：H-035-150729）（对照品，纯度＞98%，成都彼斯特生物科技有限公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂）；甲醇为色谱纯（德国默克），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 诃子的薄层鉴别[1-2]

取本品8 g，加无水乙醇30 mL，超声处理30 min（功率250 W，频率40 kHz），滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。按处方制备不含诃子药材的阴性样品，取该阴性样品粉末8 g，同法制成阴性样品溶液。另取诃子对照药材1 g，同法制备对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述2 种溶液10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置显相同颜色的斑点（见图1）。

图1 诃子薄层色谱Fig 1 TLC chromatogram of Terminalia chebula Retz.

2.2 甘草的薄层鉴别[3-5]

取本品10 g，加乙醚60 mL，加热回流1 h，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇60 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL 使溶解，以正丁醇震摇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3 次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加5 mL 甲醇使溶解，置中性氧化铝柱（100～200 目，15 g，内径为1.5 cm），用40%甲醇150 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。按处方制备不含甘草药材的阴性样品，取该阴性样品粉末10 g，同法制成阴性样品溶液。另取甘草对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成每l mL 含2 mg 的溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液、甘草对照药材、甘草对照品溶液上述4 种溶液各10 μL，对照品溶液5 μL 分别点于同一块硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置显相同颜色的斑点（见图2）。

图2 甘草薄层色谱Fig 2 TLC chromatogram of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

2.3 栀子的薄层鉴别

取本品10 g，加50%甲醇25 mL，超声处理40 min（功率250 W，频率40 kHz），滤过，取滤液作为供试品溶液。按处方制备不含栀子药材的阴性样品，取该阴性样品粉末10 g，同法制成阴性样品溶液。取栀子对照药材l g，同法制成对照药材溶液。另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1 mL 含4 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见图3。

图3 栀子薄层色谱Fig 3 TLC chromatogram of Gardenia jasminoides Elli

2.4 山楂的薄层鉴别

取本品10 g，加水60 mL，加热回流2.5 h，滤过蒸干，残渣加甲醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。按处方制备不含山楂药材的阴性样品，取该阴性样品粉末10 g，同法制成阴性样品溶液。取栀子对照药材l g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液及阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 板，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（5∶2.5∶6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇试液，在105℃加热，至呈紫红斑点，结果见图4。

图4 山楂薄层色谱Fig 4 TLC chromatogram of Crataegus pinnatifida Bge.

2.5 HPLC 法测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以水为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱（0～15 min，65%A；15～25 min，65%～45%A；25～35 min，45%A；35～40 min，45%A）；检测波长为254 nm；柱温30℃；流速1.0 mg·mL－1；进样量10 μL。

2.5.2 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品升麻苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素，加甲醇配制成质量浓度依次为4000、2800、640、720、80 µg·mL－1的混合对照品溶液。

2.5.3 供试品和阴性样品溶液的制备 取本品粉末1 g，精密称定，加入甲醇25 mL，称定重量，回流提取40 min，取出，放至室温，称重，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按处方制备不含防风药材的阴性样品，取该阴性样品粉末1 g，同法制成阴性样品溶液。

2.5.4 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在“2.5.1”项色谱条件下，5 种成分能较好分离，且阴性样品溶液无干扰，结果见图5。

图5 风诃止咳颗粒的高效液相色谱图Fig 5 HPLC chromatogram of 5 batches of Fenghe zhike granules

2.5.5 线性关系考察 按“2.5.2”项下方法配制混合对照品溶液，升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷、花椒毒素的系列质量浓度作为线性溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，以质量浓度X（µg·mL－1）为横坐标，进行回归分析，回归方程及线性范围见表1。

表1 线性关系Tab 1 Linearity

2.5.6 精密度试验 取“2.5.3”项下供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件连续进样6 次，以峰面积计算升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素的RSD值分别为0.48%、1.4%、1.1%、0.90%、1.3%，表明仪器精密度良好。

2.5.7 重复性试验 取本品6 份，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD分别为0.73%、1.6%、1.0%、0.85%、1.8%，结果显示方法重复性良好。

2.5.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按“2.5.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h 测定峰面积，结果升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD值分别为0.20%、0.46%、1.4%、0.85%、2.1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.5.9 加样回收试验 取已知含量样品6 份，按含量1∶1，分别精密加入升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素对照品溶液，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项条件下测定，计算平均回收率分别为96.8%、97.9%、95.1%、96.5%、95.8%，RSD值分别为2.2%、2.0%、1.3%、2.7%、2.7%。

2.6 样品含量测定

取3 批样品精密称定，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行检测，记录峰面积，计算样品含量，升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素平均含量分别为0.88、0.21、0.03、0.09及0.0067 mg·g－1。

3 讨论

3.1 制剂中诃子薄层研究

预试验按照2020年版《中国药典》一部诃子项下薄层条件，以甲苯-冰醋酸-水（12∶10∶0.4）为展开剂，分别于日光及紫外365 nm 下检视，特征斑点不明显且阴性样品有干扰；经摸索将展开剂调整为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1），喷以10%硫酸乙醇溶液，对照药材主斑点显色清晰Rf值适中，供试品溶液相应位置斑点达到较好分离且阴性样品无干扰。

3.2 制剂中甘草薄层研究

前期预试验发现，复方中甘草药材的薄层鉴别方法较难除去背景干扰，采用正丁醇提取后上中性氧化铝柱，对照药材、对照品及供试品色谱相应位置显相同亮黄色特异性斑点且阴性样品无干扰，分离度好且Rf值适中，方法简便易操作且，专属性强，可供其他复方中甘草药材质量标准建立提供参考。

3.3 制剂中防风成分相关研究

防风通过其疏风解表之功达清热利咽之效，宣肺散风止咳。升麻苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷具有显著的解热、镇痛、抗炎及抗凝作用，亥茅酚苷也具有一定的镇痛作用[6-8]。李悦悦等[9-10]通过RRLC-TOF/MS 分析防风入血、尿液成分发现，防风中含量高的升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷入血量很少，反而在血浆和尿液中含量最高的成分是升麻素，推测升麻素为防风主要代谢形式，升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷等苷类物质主要转化为升麻素（苷元）后才能入血被吸收，因此升麻素在防风药效发挥中的作用也相当重要，对其含量测定具有一定意义。花椒毒素是防风香豆素类化合物中的一种，具有抗炎、抗菌、抗过敏、抗凝、止血、祛痰等作用，在防风主要功效的发挥中也有一定作用，因此对以上5种成分进行含量测定。

本文针对所有药材建立质量标准，采用薄层及液相色谱针对每味药材进行质量控制，以提高复方质量标准。