水杨酸钠诱发大鼠听皮层中GABARAP表达的改变

左健李婷李雅兰1,肖倩文1,葛佳丽1, 王采集1,,3,4乔月华

1徐州医科大学（江苏221004）

2徐州医科大学形态学科研实验中心（江苏221004）

3江苏省人工听觉工程实验室（江苏221004）

4徐州医科大学附属医院（江苏221002）

5淮安市淮安医院（江苏223200）

耳鸣是指在没有相应外界声源情况下对声音的主观感知[1]。耳鸣发病率很高，严重的会引起患者焦虑和抑郁，这些负面情绪又会加重对耳鸣的感知，形成恶性循环[2,3]。耳鸣病因复杂，机制不清，目前尚无有效的耳鸣治疗方法[4]。水杨酸已成为制备耳鸣模型最广泛的药物[5]。听皮层是听觉通路上的最高级中枢，水杨酸诱发耳鸣并伴有听力损失，而这种听觉剥夺会引起听皮层的兴奋性增加和/或抑制作用减弱，导致听皮层神经自发放电活动增加及神经重塑，听皮层神经元异常兴奋[6-9]。

GABAA受体是大脑中枢中主要的抑制性受体[10]。五聚体通道可以由许多可能的亚基组成，但脑中最常见的组合由α1，β2和γ2亚基组成[11]。神经元中抑制性突触的可塑性涉及调节亚细胞区室和质膜之间的GABAA受体运输[12,13]。GABAA受体相 关 蛋 白（GABAA receptor-associated protein，GABARAP）可以在运输过程中提供GABAA受体和细胞骨架之间的联系，通过GABARAP与GABAA受体γ2亚基的胞内环结合并且与含γ2亚基GABAA受体免疫沉淀，同时与微管蛋白免疫沉淀相互作用[14-16]，从而将GABAA受体转运至胞膜上。尽管文献表明GABARAP参与神经元中GABAA受体的转运，但GABARAP在耳鸣中的作用尚不清楚。因此，本研究采用长期注射水杨酸钠建立大鼠耳鸣模型后，检测听皮层中GABARAP表达的变化，初步探讨在耳鸣中的可能机制，为耳鸣机制研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选择成年雄性Sprague Dawley大鼠126只（徐医大动物中心提供），清洁级，体重250-300g，大鼠无强声暴露、耳毒性药物等使用史,随机分组。本实验过程符合徐医大动物中心动物管理条例规定。

1.1.2 实验试剂

水杨酸钠（美国Sigma公司s3007），GABARAP引物（生工生物工程有限公司），GAPDH引物（生工生物工程有限公司），BCA检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司P0010），兔多克隆抗GABARAP抗体（美国Novus公司NBP1-71771），鼠单克隆抗GAPDH抗体（美国Proteintech公司60004-1-ig）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备

耳鸣模型分组基于先前的研究[17,18]。随机分为7组：对照注射、慢性注射7天组；对照注射、慢性注射14天组；停药后恢复3天组、7天组及14天组（对照组200mg/kg生理盐水腹腔注射，于上午8时和下午4时各注射一次，按天数注射；实验组200mg/kg水杨酸钠腹腔注射，操作同上）。所有动物分别造模成功后于的第二天上午8时处死。

1.2.2 惊跳反射抑制（Pre-Pulse Inhibition，PPI）

耳鸣检测参照以往研究[19]。隔音屏蔽室中检测不同组别大鼠前脉冲惊跳刺激的PPI值来进行比较。所用PPI程序：在给予惊跳反射刺激（ASR）前，发放三种不同强度的前脉冲惊跳刺激75 dB SPL、80dB SPL和 85dB SPL（分别为 PPI2，PPI4和PPI8）。每次实验，将大鼠置于65dB SPL白色背景噪声中适应，先为大鼠随机分配10次115dB SPL脉冲刺激，然后通过扬声器30次随机声刺激（10次115dB SPL脉冲刺激、10次没有前声的惊跳反射刺激和10次前脉冲惊跳反射刺激）。根据公式PPI%=1-(ASR-PPI)/ASR×100%来计算前脉冲抑制率。

1.2.3 实时荧光定量PCR

每组6只大鼠用3%戊巴比妥那（30mg/kg）麻醉后，断头取脑迅速分离出听皮层。采用Trizol法提取总RNA，根据PCR试剂盒说明书逆转录为cDNA。上海生工设计合成引物，引物序列为5’to 3’：GABARAP 上 游 TTGTCAACAATGTCATTC‐CACC， 下 游 TCTCTTTGTAGAATGGAACCCC；GAPDH上游 AGACAGCCGCATCTTCTTGT，下游CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。PCR反应体系：EvaGreen 2x qPCR MasterMix 5µL，PCR Forward Primer(10µM)0.5µL，PCR Reverse Primer(10µM)0.5µL，DNA 模板 1µL，dH20 3µL，总体积 10.0µL。各基因表达变化采用比较阈值法即计算2—△△CT。

1.2.4 Western Blot

每组6只大鼠麻醉后，断头取脑迅速分离出听皮层。提蛋白，测蛋白浓度，电泳完后转膜。封闭，4℃孵育多克隆抗GABARAP（1:1000）和鼠单克隆抗GAPDH（1:5000）摇床过夜。洗涤条带，孵二抗，洗涤条带，扫描条带。选用GAPDH作为内参，并用Image J软件分析。

1.2.5 免疫荧光

每组6只麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定。脱水包埋。冰冻切片16µm。抗原修复，漂洗，封闭，一抗孵育过夜。次日漂洗，孵二抗，再漂洗。加一滴免洗DAPI，封片，正置荧光显微镜下观察拍照。每组计数18张脑片单位面积平均荧光强度，取其平均值。

1.2.6 统计

数据处理使用SPSS19.0统计软件。两组间均数差异性比较使用独立样本t检验，多组间均数差异性比较使用单因素方差分析（Dunnett事后检验）。均数±标准差用于表示计量资料，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水杨酸钠成功诱导大鼠耳鸣样行为

不同组别大鼠的PPI值（）（图1、表1）。与对照组比较，慢性注射7天组，PPI2、PPI4和PPI8均显著升高（t=-7.033,P=0.002;t=-4.769,P=0.009;t=-4.881,P=0.008,P<0.05）。慢性注射14天组和停药后恢复3天组较对照组，PPI2、PPI4和PPI8均显著升高（F=8.516,P=0.046,P=0.009;F=9.742,P=0.046,P=0.000;F=2.667,P=0.027,P=0.006,P<0.05）；停药后恢复7天组、14天组与对照组比较，PPI2、PPI4和PPI8无显著差异（F=8.516,P=0.551,P=0.171;F=9.742,P=0.591,P=0.058;F=2.667,P=0.317,P=0.073,P>0.05）。前脉冲抑制率越大，惊跳反射被抑制就越小。耳鸣填补前脉冲刺激，从而减小前抑制作用。

图1 水杨酸钠对前脉冲抑制率的影响。A：慢性注射7天组大鼠的PPI抑制率；B：慢性注射14天组、停药后恢复3天组、7天组及14天组大鼠的PPI抑制率；数值用均数±标准差表示；前脉冲刺激：PPI2：75dB SPL；PPI4:80dB SPL；PPI8：85dB SPL(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.1 Effect of sodium salicylate on pre-pulse inhibition.A:The PPI inhibition rate of rats in SS7d;B:The PPI inhibition rate of rats in SS14d,HF3d,HF7d and HF14d(Values are ex‐pressed as mean±SD;pre-pulse stimulation:PPI 2,75dB SPL;PPI4,80dB SPL;PPI8,85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,respectively)

表1 行为测量：不同组别间PPI值比较Table 1 Behavioral testing：Comparisons of PPI values among seven groups

2.2 GABARAP在听皮层中mRNA的表达

慢性注射7天组与对照组相比，GABARAP mRNA表达无显著差异（t=-0.376,P=0.732,P>0.05）；慢性注射14天组、停药后恢复3天组、7天组和14天组与对照组的差异均无统计学意义（F=0.017,P=0.999,P=0.848,P=0.902,P=0.133,P>0.05）。（图2）。

图2 各组大鼠听皮层中GABARAP mRNA的表达。A：SS7d组 GABARAP mRNA 表达无明显变化（P>0.05）（n=6）；B：SS14d、HF3d、HF7d、HF14d组与NS14d组比较，GABARAP mRNA表达没有差异性（P>0.05）（n=6）。Fig.2 GABARAP mRNA expression in the auditory cortex of each group of rats..A:No significant change in GAB‐ARAP mRNA expression in SS7d(P>0.05)(n=6);B:There was no difference in GABARAP mRNA expression between SS14d,HF3d,HF7d,HF14d and NS14d(P>0.05)(n=6).

2.3 GABARAP在听皮层中蛋白的表达

慢性注射7天组与对照组相比，GABARAP蛋白表达升高（t=-2.403,P=0.037,P<0.05）；慢性注射14天组与对照组相比，GABARAP蛋白表达明显升高（F=6.891,P=0.000,P<0.001），停药后恢复3天组、7天组和14天组与对照组比较，GABARAP蛋白表达的差异没有统计学意义（F=6.891,P=0.089,P=0.431,P=0.133,P>0.05）（图3）。

图3 各组大鼠听皮层中GABARAP蛋白的表达A：慢性注射7天组GABARAP蛋白表达升高（*P<0.05）（n=6）；B：慢性注射14天组GABARAP蛋白表达明显升高（***P<0.001）（n=6）；停药后恢复3天组、7天组和14天组，GABARAP蛋白表达无明显变化（P>0.05）（n=6）。Fig.3 GABARAP protein expression in the auditory cortex of each group of rats.A:The expression of GABARAP pro‐tein increased in SS7d(*P<0.05)(n=6);B:The expression of GABARAP protein was significantly higher in SS14d(***P<0.001)(n=6);There was no significant change in the expres‐sion of GABARAP protein in HF3d,HF7d and HF14d(P>0.05)(n=6)

2.4 GABARAP在听皮层中荧光的表达

慢性注射7天组与对照组相比，GABARAP荧光表达升高（t=-3.315,P=0.008,P<0.05）；慢性注射14天组与对照组相比，GABARAP荧光表达明显升高（F=8.616,P=0.000,P<0.001），停药后恢复3天组、7天组和14天组与对照组比较，GABARAP荧光表达的差异没有统计学意义（F=8.616,P=0.367,P=0.412,P=0.679,P>0.05）（图4）。

图4 各组大鼠听皮层中GABARAP荧光的表达.。A：慢性注射7天组GABARAP平均荧光强度升高（*P<0.05）。B：慢性注射14天组GABARAP平均荧光强度明显升高（***P<0.001）。停药后恢复3天组、7天组和14天组与对照组比较，GABARAP平均荧光强度的差异没有统计学意义（P>0.05）。数据用均数±标准差表示（n=6），标尺50μm，标记的标尺20μm。Fig.4 GABARAP fluorescence expression in the auditory cortex of each group of rats.A:The average fluorescence in‐tensity of GABARAP increased in SS7d(*P<0.05).B:The av‐erage fluorescence intensity of GABARAP was significantly increased in SS14d(***P<0.001).There was no significant dif‐ference in the mean fluorescence intensity of GABARAP be‐tween HF3d,HF7d and HF14d(P>0.05).The data were ex‐pressed as mean ± SD(n=6),and the scale was 50μm，the scale of marked ruler was 20μm.

3 讨论

大剂量的水杨酸会引起人和动物强烈的耳鸣感。而PPI抑制率升高是动物耳鸣的表现[19]。PPI检测反映了高级认知中枢对听觉信息快速处理过程的调节[20]。与对照组相比，水杨酸钠连续注射7天、14天组及停药后恢复3天组大鼠的PPI抑制率显著升高，这说明大鼠感知到了耳鸣。而停药后恢复7天、14天组后大鼠PPI抑制率无明显变化，表明耳鸣消失。Eggermont等人也指出，摄入大量的水杨酸会引起耳鸣和听力下降，但是在停药后这些症状会逐渐消失[21]。这与本研究一致，注射大剂量水杨酸钠后，大鼠出现耳鸣，停药恢复后大鼠耳鸣慢慢消失。

大脑中抑制性神经传递主要由通过GABAA受体介导作用的[22]。突触后膜中GABAA受体的数量直接控制GABA能突触传递的功效[23]。GABAA受体的运输是调节抑制性突触可塑性途径的重要组成部分[24]。GABAA受体相关蛋白（GABARAP）对含有γ2亚基的GABAA受体的影响主要有两个方面：（1）调节离子通道的特性，可能是通过促进受体的聚集；（2）可能通过增加受体的细胞内运输来调节细胞表面表达[25]。过表达GABARAP将会增加细胞膜表面GABAA受体的表达水平，相反，干扰GABARAP与GABAAR的γ2亚基丝氨酸磷酸化位点结合，则会导致GABAA受体表达水平的降低[24,26]。听皮层过度兴奋是耳鸣的感知基础，在本实验中，长期注射水杨酸钠诱导的耳鸣大鼠听皮层中GABARAP的mRNA表达没有变化，可能水杨酸钠并不影响GABARAP的转录水平。而水杨酸钠慢性注射7天、14天组，耳鸣大鼠听皮层中GAB‐ARAP的蛋白和荧光表达都显著升高；停药后恢复3天、7天及14天组，GABARAP的蛋白和荧光表达无显著差异。这表明，在水杨酸诱导的耳鸣大鼠听皮层中，GABARAP表达增高，间接导致细胞膜表面的GABAA受体的表达水平升高。水杨酸钠诱发耳鸣会伴随听皮层的兴奋活动增加，这可能会导致抑制性受体GABAA受体的反馈性升高，来弥补兴奋性受体的兴奋毒作用，并随着耳鸣的恢复GABAA受体逐渐恢复正常。GABARAP也与gephyrin相互作用，gephyrin与微管结合，并且已知是将甘氨酸和GABAA受体锚定在质膜上的重要成分[27,28]。GABARAP不仅运输GABAA受体，而且运输GABAA受体功能所需的其他蛋白质，例如gephy‐rin[25]。在长期水杨酸钠应用的耳鸣大鼠听皮层中，GABARAP的表达增加也可能是其他运输GABAA受体功能的蛋白质数量升高导致的。

总之，长期水杨酸钠应用导致大鼠耳鸣，这与听皮层中转运蛋白GABARAP表达增多有关。然而，在水杨酸钠诱导的动物耳鸣中，GABARAP运输GABAA受体的确切信号通路过程还需要进一步的研究来证实。