豚鼠耳蜗在不同中间液中扫描电镜制样效果的比较研究

曹鋐 崔颖

锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科

扫描电镜能够将耳蜗的表面的结构放大几千至上万倍，并且其具有景深长，离体感强等特点。因此能够根据样本表面的三维结构对样本进行综合分析。但是由于其镜筒内部是高真空的环境，水分在真空环境下挥发由于表面张力的缘故，会引起样本收缩，破坏样本微细结构，因此样本在进行观察之前要将样本进行脱水干燥处理[1]。

由于耳蜗样本中含有大量的水分，其无法与液态的CO2进行置换，因此要将耳蜗中的水分置换成能够与液态CO2互溶的中间液体。醋酸异戊酯由于其与液态二氧化碳良好的相溶性，被广泛的作为临界点干燥法的中间液使用[2-4]。但其操作繁琐，易挥发，对眼及上呼吸道粘膜有刺激性。为提高实验效率，简化实验流程，减少醋酸异戊酯因挥发对空气环境的污染，保护了实验人员的安全，本文拟在常规豚鼠耳蜗扫描电镜样本制备方法的基础上进探索新的中间液，并且利用扫描电镜进行观察对比两种中间液的置换效果，旨在建立一种安全、有效、无污染的样本制备方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：豚鼠6只，体重200-250g，2月龄，雌雄不限，购自维通利华动物饲养中心。耳廓反射良好。实验豚鼠左耳为醋酸异戊酯组（对照组，con‐trol group），右耳为无水乙醇组（实验组，experi‐mental group）。

实验试剂：1%戊巴比妥钠溶液，2.5%戊二醛溶液，0.1M PB溶液，1%四氧化锇溶液，10%EDTA溶液，50%酒精溶液，75%酒精溶液，90%酒精溶液，无水乙醇，醋酸异戊酯，银导电胶。

实验设备：解剖显微镜，临界点干燥仪，离子溅射仪，场发射扫描电镜。

实验器械：2ml无菌注射器，眼科剪，咬骨剪，游丝镊，组织剪，6cm玻璃皿，3ml移液管，15ml离心管，样品台。

1.2 方法

1.2.1 耳蜗取材固定

1%戊巴比妥钠腹腔注射至豚鼠于深度麻醉，迅速断头取出双侧耳蜗。用咬骨剪打开听泡，暴露耳蜗耳蜗圆窗，前庭窗。将其置于盛有2.5%的戊二醛溶液的玻璃皿中，于解剖显微镜下用游丝镊将蜗尖挑破，并且将圆窗膜、前庭膜刺破。用移液管吸取2.5%的戊二醛固定液从蜗尖处缓慢注入，观察前庭窗、圆窗处有淋巴液流出，重复3-4次，使固定液充满耳蜗内部腔隙。将固定好的耳蜗置于4℃于24小时。

1.2.2 脱钙

将固定好的耳蜗置于10%EDTA溶液进行脱钙处理5-7天。

1.2.3 解剖内耳组织显露观察面

将脱钙后的耳蜗置于盛有0.1M PB溶液的培养皿中，在解剖显微镜下用游丝镊先将耳蜗的骨质去除，充分暴露膜迷路。游丝镊自顶转至底转沿基底膜外侧轻轻划开，将螺旋韧带血管纹与基底膜分离。将前庭膜、盖膜依次撕掉，只保留基底膜于蜗轴上。

1.2.4 内耳组织处理

分别经四氧化锇固定2h和单宁酸浸泡1h后，期间分别将耳蜗置于0.1M的磷酸缓冲中清洗1h。最后将耳蜗置于50%,70%,90%,100%不同浓度的乙醇溶液中进行梯度脱水处理,每个梯度脱水1h。

1.2.5 中间液处理

实验组直接将耳蜗浸没于无水乙醇中，启动临界点干燥仪，进行干燥处理；

对照组将耳蜗置于醋酸异戊酯中，室温条件下静置1小时。用醋酸异戊酯将耳蜗组织中的无水乙醇置换出来。启动临界点干燥仪，进行干燥处理。

1.2.6 离子溅射仪喷金处理

将两组样本分别用银导电胶固定到铜制样品台上，待其干燥后置于离子溅射仪上进行喷金处理。

1.2.7 场发射扫描电镜观察及图像采集

将耳蜗标本置于场发射扫描电镜SU8200中，在1500×,2000×，6000×，8000×,12000×,15000×下观察耳蜗不同位置的内毛细胞（inner hair cells,IHC）纤毛、外毛细胞（outer hair cells,OHC）纤毛、表皮板，及微绒毛的状态，并采集图像。

2 结果

实验组同对照组相比较减少了醋酸异戊酯置换无水乙醇的步骤，相对节省了1个小时的实验时间。

实验组与对照组在不同放大倍数的情况下观察耳蜗不同位置的内毛细胞纤毛，外毛细胞纤毛，表皮板，及微绒毛的状态比较，二者成像质量上并未差异（图1和图2）。

图1 实验组（A—C）分别是正常豚鼠耳蜗的底圈，中圈，顶圈。AB图显示出完整的IHC和OHC纤毛整齐排列，C图显示底圈的第三排外毛细胞纤毛排列较凌乱，第一二排排列整齐。A1，B1，C1是底转，中转，顶转的IHC局部放大图，可见该处纤毛排列完整，未见内主细胞表皮板（IPH）和内缘细胞（BC）因表面张力导致细胞表面断裂。A2，B2，C2是底转，中转，顶转的OHC局部放大图，可见该处纤毛排列完整，未见Deiter细胞指突因表面张力导致细胞表面断裂。Fig.1 A-C:was the basal turn,the middle turn and the apex turn of the normal guinea pig cochleae in experimental group.Panel A and B showed the complete and orderly arranged cilia of the inner hair cells(IHC)and outer hair cells(OHC).Panel C showed that the cilia in the third row of outer hair cells in the basal turn were arranged in disorder,while the first and second rows were arranged in order.Panel A1,B1 and C1 were the local enlarged view of the IHC cilia,which were complete and orderly arranged,and there were no surface frac‐ture of IPH and BC which may have caused by surface ten‐sion of the cells.Panel A2,B2 and C2 were the local enlarged view of the OHC cilia,which were complete and orderly ar‐ranged,and there were no surface fracture of Deiter cells’phalangeal process which may have caused by surface tension.

图2 对照组（A—C）分别是正常豚鼠耳蜗的底圈，中圈，顶圈。ABC图显示出完整的IHC和OHC纤毛整齐排列。A1，B1，C1是底转，中转，顶转的IHC局部放大图，可见该处纤毛排列完整，内毛细胞表皮板（IPH）和内缘细胞（BC）结构完整。A2，B2，C2是底转，中转，顶转的OHC局部放大图，可见该处纤毛排列完整，未见Deiter细胞指突结构完整。图1和图2成像效果未见明显差异，均保留了良好的形态结构。Fig.2 A-C:was the basal turn,the middle turn and the apex turn of the normal guinea pig cochleae in control group.Panel A,B and C showed the complete and orderly arranged cilia of the inner hair cells(IHC)and outer hair cells(OHC).Panel A1,B1 and C1 were the local enlarged view of the IHC cilia,which were complete and orderly arranged,and showed the intact structure of IPH and BC.Panel A2,B2 and C2 were the local enlarged view of the OHC cilia,which were complete and orderly arranged,and showed the intact structure of Deit‐er cells’phalangeal process.These results showed the good morphological structure retained,and the imaging effects had no significant differences.

3 讨论

耳蜗是动物体内重要的听觉感受器官，由基底膜，血管纹，螺旋韧带，螺旋神经节等结构组成。基底膜振动时毛细胞的纤毛和盖膜之间发生剪切运动，导致纤毛弯曲，从而产生毛细胞的生物电变化，此时声音传递由机械信号转换为电信号的传递，由此可见毛细胞纤毛在声音传递过程中承担着举足轻重的作用[4-6]。正常生理条件下外毛细胞的纤毛呈V字状整齐排列，内毛细胞纤毛呈一字状排列，当遭遇到外界物理因素或者化学因素造成纤毛大量的倒伏，断裂，凋亡。比如强烈脉冲噪声或者长时间的白噪声或化疗药物均能对毛细胞纤毛造成不可逆损伤。纤毛固定在毛细胞顶端的表皮板上，每个内毛细胞的纤毛为30-60根，外毛细胞的纤毛为20-400根，因此要深入研究纤毛的物理状态，常规的光学显微镜分辨率能力不能达到[9-12]。因此根据扫描电镜景深长，离体感强等特点。用扫描电镜对样本表面的三维结构进行综合分析。

由于动物组织含有大量的水分，直接置于扫描电镜的真空环境中，水分大量挥发，样本会因表面张力而造成损伤无法对样本进行准确分析研究。常用的组织干燥方法有临界点干燥法，莰烯干燥法，叔丁醇干燥法，乙腈干燥法，冷冻干燥法，对位二氯苯干燥法等[3]。液体CO2临界点干燥法是耳蜗扫描样本制备过程中不可或缺的方法，根据玻尔兹曼因子等温线可以得到液态的CO2在密闭环境中达到31.1℃，72.3atm的大气压下能够发生气液面消失[7,8]（图3）。

图3 CO2实验实测的等温线[7]图示为p-Vm图，当温度低于临界温度Tc时，CO2气液相变等温线的直线段，随着温度升高，其直线段逐渐缩短。当温度到达临界温度Tc时，饱和CO2液体和饱和CO2气体界面消失，此为临界状态，临界压力为72.3atm，临界温度为31.1℃。当温度大于48.1℃时，等温线为相对均匀的曲线。Fig.3 The measured isotherm of CO2experiment.Fig shows the P-VM diagram.When the temperature is lower than the critical temperature Tc,the straight line segment of the CO2 gas-liquid phase variable isotherm gradually shrinks as the temperature rises.When the temperature reaches the critical temperature Tc,the interface between saturated CO2liquid and saturated CO2gas disappears.This is the critical state.The critical pressure is 72.3 ATM and the critical temperature is 31.1℃.When the temperature is greater than 48.1℃,the isotherm is a relatively uniform curve.

醋酸异戊酯由于其与液态二氧化碳良好的相溶性，被广泛的作为临界点干燥法的中间液使用。

在研究喉下腔粘膜假复层纤毛柱状上皮细胞，小肠绒毛,支气管绒毛等含水丰富的组织器官中，经过戊二醛，四氧化锇的双固定，酒精脱水，醋酸异戊酯作为中间液置换酒精，经过临界点干燥仪干燥，离子溅射仪喷金处理后于扫描电镜观察，均未发生因表面张力导致的样本的损坏，并且完整的保存了样本的自然面貌[13]。耳蜗器官含水量较上述器官较少，因此醋酸异戊酯在耳科扫描电镜制样的应用效果较好，应用范围更为广泛，比如能够详细的反应因枪炮脉冲造成耳蜗毛细胞纤毛的断裂、倒伏、散乱、脱落，氨基糖苷类药物造成毛细胞变性，纤毛的凋亡缺失[4]。

但是由于操作过程中会因环境温度较低的情况下在排气管出发生冷凝返流到样品室影响干燥效果，并且由于醋酸异戊酯蒸汽对眼及呼吸道粘膜有刺激性，会造成实验人员麻醉，咳嗽，胸闷，恶心，头痛，耳鸣，皮炎湿疹等危害[14]。与此同时当对含有大量脂质物质的样本进行干燥时，因醋酸异戊酯能溶解脂质物质，因此与要避免使用醋酸异戊酯的使用。

本实验通过用无水乙醇代替醋酸异戊酯作为中间液，通过扫描电镜观察耳蜗的超微结构未发现因表面张力变化导致的组织断裂，成像效果同使用醋酸异戊酯组一样，完整的还原了组织的结构。并且该实验方法的改进，减少了实验步骤，缩短了实验时间，减避免了因醋酸异戊酯而造成的环境污染，保护了实验人员的健康。