电离辐射促进神经胶质瘤细胞初级纤毛发生

马 伟 马青龙 魏 丽 华君瑞 何进鹏 王菊芳

1（中国科学院近代物理研究所 甘肃省空间辐射生物学重点实验室 兰州730000）

2（中国科学院大学 北京100049）

3（兰州大学基础医学院 兰州730000）

4（甘肃省人民医院检验科 兰州730000）

初级纤毛（Primary cilia）是一种源于基体（母中心粒特化结构）、以微管为基础的突出于细胞膜表面的“毛状”细胞器，存在于绝大多数哺乳动物细胞中。初级纤毛是细胞感知胞外物理、化学和生物信号的关键细胞器，介导多种信号通路的激活和转导［1-2］，其发生过程受严密的细胞周期调控［3］。早期研究发现，在多种类型肿瘤细胞及实体瘤组织中均有初级纤毛缺失现象，推测初级纤毛缺失与肿瘤细胞周期失控相关［4-6］。然而，近期研究不但报道宫颈癌及胃肠道间质瘤等肿瘤细胞具有初级纤毛［7-8］，而且发现初级纤毛与肿瘤化疗抵抗密切相关［9］，提示初级纤毛可能在调控肿瘤细胞的应激响应进程中发挥重要作用。

电离辐射（Ionizing radiation，IR）会引起DNA 损伤，导致染色体畸变和中心粒过度复制等基因组不稳定现象［10］。目前，有报道证实紫外线和γ射线照射会促进人成肌细胞、上皮细胞等正常细胞的初级纤毛发生率升高［11-13］。然而，电离辐射是否影响肿瘤细胞初级纤毛的发生和生长，及初级纤毛是否影响肿瘤细胞对电离辐射的应激响应仍未见报道。人神经胶质瘤细胞系（M059K 和M059J）来源于同一神经胶质瘤患者，然而这两种细胞对DNA 损伤的敏感性存在较大差异，相关的分子机制仍未完全阐明。本研究以M059K 和M059J为研究对象，采用X射线和碳离子束进行照射处理，通过免疫荧光、RNA 干扰及细胞克隆等方法研究电离辐射对神经胶质瘤细胞初级纤毛发生及初级纤毛对细胞电离辐射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人神经胶质瘤细胞系M059K 和M059J 购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）；DMEM/F-12 培养基购自美国GIBICO公司；胎牛血清购自以色列BI公司；青霉素及硫酸链霉素购自美国Sigma 公司。Arl13b（ADP ribosylation factor-like 13b）一抗购自美国Proteintech公司，γ-Tubulin（γ-Tub）一抗购自美国Sigma 公司，荧光二抗（Alexa Fluor 594 和Alexa Fluor 488）购自美国ThermoFisher 公司，IFT88 基因 siRNA （siIFT88， 序 列 为 ： 5′-GAAGAAAGCUGUAUUGCCAAUAGUU-3′ ， 3′-AACUAUUGGCAAUACAGCUUUCUUC-5′ ） 、siRNA 阴性对照（Negative control，NC）及转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养

M059K和M059J细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青 霉 素 和100 μg/mL 硫 酸 链 霉 素 的DMEM/F-12完全培养基中，并于5%CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中培养。

1.3 细胞照射

细胞培养至对数生长期后进行照射处理。X射线由PXI Precision X-RAY225照射系统产生，电压为225 kV，电流为13.3 mA，剂量率为2 Gy/min；碳离子束由中国科学院兰州重离子加速器（Heavy ion research facility in Lanzhou，HIRFL）浅层治疗终端提供，能量为80 MeV/u，传能线密度（Linear energy transfer，LET）为30 keV/μm，剂量率为2 Gy/min。

1.4 初级纤毛免疫荧光检测

通过对Arl13b和γ-Tub进行免疫荧光染色指征初级纤毛和基体。其中，Arl13b 属于小GTP 酶家族，特异定位在初级纤毛膜上［14］；γ-Tub是中心粒结构蛋白［15］。细胞经不同剂量的X 射线或碳离子束照射处理并继续培养24～72 h，利用4%多聚甲醛室温固定10 min后，使用含0.5%Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）透膜5 min，然后用含5%山羊血清的PBS 室温封闭2 h，之后用Arl13b（1∶500）和γ-Tub（1∶500）一抗孵育2 h，荧光二抗（1∶500）室温避光孵育2 h，使用含0.5%Tween-20 的PBS 洗 片 并 使 用DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）封片。荧光显微镜采集图片并进行统计分析，随机统计15 个以上视野（不少于500个细胞）。利用ImageJ 软件测量100 个以上初级纤毛长度并计算平均长度。

1.5 初级纤毛干扰

利用siRNA敲低纤毛转运蛋白IFT88的表达抑制初级纤毛发生。将siIFT88 与Lipofectamine 2000共转染细胞，5 h后更换新鲜培养基并继续培养24 h，固定细胞进行免疫荧光染色，观察和统计初级纤毛发生率及长度，以判断初级纤毛抑制效率。

1.6 细胞克隆形成

以照射至吸收剂量2 Gy 时细胞的相对存活率（Survival fraction at 2 Gy，SF2，以变量fS2表示）征细胞的辐射敏感性。细胞转染siIFT88 或阴性对照NC后分别进行X射线或碳离子束照射至吸收剂量2 Gy。消化细胞，取适量细胞（X射线组为1 000个，碳离子组为2 000个）接种于60 mm的培养皿中，置于培养箱中培养12 d，75%乙醇固定5 min后用0.5%结晶紫染液染色3 min，大于50 个细胞的集落视为有效克隆。

克隆形成率=有效克隆数/接种细胞数×100%。

fS2=照射后形成的克隆数/（照射前种植细胞数×未照射细胞的克隆形成率）。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 神经胶质瘤细胞初级纤毛检测

利用免疫荧光技术标记Arl13b和γ-Tub指征初级纤毛的位置和形态，检测了人神经胶质瘤细胞M059K 和M059J 初级纤毛表达情况。结果显示：M059K和M059J均具有初级纤毛（图1（a）），但两种细胞的初级纤毛发生率明显不同，M059K 初级纤毛发生率为(41.36±4.75)%，而M059J 仅为(8.07±1.58)%（图1（b））。此外，两种细胞初级纤毛平均长度都超过3 μm，而M059K的初级纤毛平均长度要高于M059J（图1（c））。以上结果表明神经胶质瘤细胞具有初级纤毛结构，但初级纤毛的发生率和平均长度在不同细胞间存在差别。

图1 神经胶质瘤细胞M059K和M059J初级纤毛发生率和长度检测：（a）M059K和M059J初级纤毛免疫荧光图像（白色箭头指示初级纤毛，Arl13b（红色）表示初级纤毛，γ-Tub（绿色）表示基体，DAPI（蓝色）表示细胞核，彩色见电子版）；（b）M059K和M059J细胞初级纤毛发生率；（c）M059K和M059J初级纤毛平均长度；**p＜0.01，M059J vs.M059KFig.1 Detection of the primary cilia incidence and length in glioblastoma M059K and M059J cells:(a)representative immunofluorescence images of the primary cilia in M059K and M059J(white arrows indicate primary cilia,primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);(b)quantification of the ciliated cells in M059K and M059J;(c)quantification of primary cilia length in M059K and M059J;**p＜0.01,M059J vs.M059K

2.2 初级纤毛发生率与细胞辐射敏感性的相关性

近期研究发现［9］，化疗药物耐受的肺癌细胞株初级纤毛发生率显著升高，表明初级纤毛参与调控细胞的DNA 损伤应激响应进程，推测初级纤毛与细胞的电离辐射应激响应及辐射敏感性相关。利用X 射线和碳离子束分别对M059K 和M059J 细胞进行不同剂量照射并检测细胞相对存活率（图2）。

图2 初级纤毛发生率影响神经胶质瘤细胞辐射敏感性：（a）不同剂量X射线照射下M059K和M059J的细胞存活率；（b）不同剂量碳离子束照射下M059K和M059J的细胞存活率；*p＜0.05,**p＜0.01,and***p＜0.001,M059J vs.M059KFig.2 Incidence of primary cilia affects the cellular sensitivity to IR in glioblastoma:(a)cellular survival fraction of M059K and M059J cells exposed to X-ray irradiation at different doses;(b)cellular survival fraction of M059K and M059J cells exposed to carbon ion irradiation at different doses;*p＜0.05,**p＜0.01,and***p＜0.001,M059J vs.M059K

结果显示，经X 射线或碳离子束照射后，M059K 和M059J 细胞的相对存活率均随吸收剂量增大而显著降低，并且碳离子束对细胞的杀伤效果更为显著，而相同吸收剂量处理时，M059K 的相对存活率均明显高于M059J，表明初级纤毛发生率低的M059J 细胞较初级纤毛发生率高的M059K细胞对电离辐射（X射线和碳离子束）更敏感。结合M059K 和M059J 细胞初级纤毛发生率的不同（图1），以上结果提示神经胶质瘤细胞初级纤毛发生率与细胞电离辐射敏感性之间可能存在负相关性。

2.3 X射线影响神经胶质瘤细胞初级纤毛发生

电离辐射能够促进正常细胞初级纤毛的发生［12-13］，但电离辐射是否影响肿瘤细胞初级纤毛的发生和功能仍不清楚。对M059K 和M059J 细胞进行不同剂量X 射线照射处理，并在照射后24 h利用免疫荧光法检测Arl13b和γ-Tub的表达，结果显示X 射线照射同样具有诱导M059K 细胞初级纤毛发生的作用，且初级纤毛发生率随着吸收剂量的增加逐渐提高，当剂量为10 Gy时，初级纤毛发生率已接近60%（图3（a））。此外，初级纤毛发生率还与照射处理后检测时间点相关，10 Gy X射线照射后72 h 时，M059K 细胞的初级纤毛发生率进一步升高至（78.40±2.28）%。然而，M059J 细胞初级纤毛发生率在X 射线照射前后无明显变化（图3（a））。值得注意的是，随着吸收剂量的增加，M059K 细胞中多纤毛细胞和异常结构纤毛细胞的比例明显升高（图3（b）），提示X射线引起的初级纤毛发生和纤毛结构异常可能与M059K 细胞较高的辐射耐受能力相关。以上结果表明，X射线能促进M059K 细胞纤毛发生，并且X 射线诱导初级纤毛发生的作用具有剂量和时间效应。

图3 X射线对M059K细胞初级纤毛发生的影响：(a)不同剂量X射线照射M059K和M059J细胞后的初级纤毛发生率；(b)X射线照射后M059K的多纤毛细胞免疫荧光图像（Arl13b（红色）表示初级纤毛，γ-Tub（绿色）表示基体，DAPI（蓝色）表示细胞核，彩色见电子版）；*p＜0.05,照射组vs.对照组Fig.3 Effects of X-ray on ciliogenesis in M059K cells:(a)quantification of the ciliated cells in M059K and M059J cells exposed to X-ray irradiation;(b)immunofluorescence images of multi-ciliated cells in M059K cells exposed to X-ray irradiation(primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);*p＜0.05,ionizing radiation group vs.control group

2.4 初级纤毛调控神经胶质瘤细胞的辐射敏感性

上述结果证实初级纤毛与神经胶质瘤细胞辐射敏感性相关，且电离辐射能够促进M059K 细胞初级纤毛发生，然而初级纤毛是否具有调控M059K细胞的辐射敏感性的功能仍未明确。目前，通常采用siRNA技术敲低IFT88基因表达达到干扰初级纤毛发生的效果［16］。M059K细胞转染siIFT88后，免疫荧光结果显示，抑制IFT88基因表达能有效降低X 射线引起的初级纤毛发生，且初级纤毛平均长度明显变短（图4（a））。以SF2 评估M059K 细胞的电离辐射敏感性，细胞经X 射线或碳离子束照射处理后克隆存活实验结果显示（图4（b）、（c）），转染siIFT88 干扰初级纤毛发生后与阴性对照相比，细胞SF2 值在X 射线照射时由0.58±0.05 降至0.21±0.04（p＜0.01），在碳离子束照射时由0.37±0.04降至0.19±0.02（p＜0.05），表明靶向初级纤毛能显著提高M059K细胞的辐射敏感性，同时提示初级纤毛可能参与调控M059K 细胞的辐射敏感性。

图4 干扰初级纤毛提高神经胶质瘤细胞的辐射敏感性：(a)M059K细胞在siIFT88干扰初级纤毛以及X射线照射后的免疫荧光图像（白色箭头指示初级纤毛，Arl13b(红色)表示初级纤毛，γ-Tub(绿色)表示基体，DAPI(蓝色)表示细胞核，彩色见电子版）；(b)siIFT88或NC处理M059K细胞并在2 Gy X射线或碳离子照射下形成的细胞克隆图像；(c)X射线或碳离子束照射下M059K细胞的SF2定量分析；*p＜0.05，**p＜0.01，siIFT88 vs.NCFig.4 Interference of primary cilia enhances the radiosensitivity of glioblastoma cells:(a)immunofluorescence images of primary cilia treated with siIFT88 in IR-exposed M059K cells(white arrows indicate primary cilia;primary cilia were stained for Arl13b(red)and γ-Tub(green),and the nuclei were stained with DAPI(blue),color online);(b)photographs of colonies formed by M059K cells treated with siIFT88 or NC and exposed to 2 Gy of X-rays or carbon ions irradiation;(c)SF2 of M059K cells exposed to X-ray or carbon ion irradiation;*p＜0.05,**p＜0.01,siIFT88 vs.NC

3 讨论

初级纤毛作为细胞的“天线”，通过调控Hedgehog、Wnt、TGF-β、Notch 等多种信号通路感应物理、化学和生物信号刺激，其结构和功能异常会导致一系列疾病［17-18］，包括肿瘤的发生和发展［19］。一方面，研究发现多种类型的肿瘤细胞缺失初级纤毛［4-6］，通过药物诱导初级纤毛能有效抑制肿瘤细胞增殖［20］；另一方面，人基底细胞癌等部分类型肿瘤细胞高度依赖于初级纤毛介导的Hedgehog 通路，抑制初级纤毛能够有效降低细胞活性［21］。此外，在人宫颈癌和胃肠道间质瘤等类型的肿瘤中同样保留了一定比例具有初级纤毛的肿瘤细胞［7-8］，表明初级纤毛是维持肿瘤细胞功能所必需的重要细胞器。本研究发现，人神经胶质瘤M059K 和M059J 均具有初级纤毛，这与早期神经胶质瘤细胞及组织检测到初级纤毛的报道结果相一致［22］。然而，初级纤毛在神经胶质瘤细胞中发挥的生物学功能仍有待研究。

电离辐射是否影响肿瘤细胞初级纤毛发生还未见有相关的报道。本研究首次发现电离辐射（X射线和碳离子束）能够促进神经胶质瘤细胞M059K初级纤毛的发生和延长（图3（a）），并且随着辐照剂量的增加多纤毛和异常纤毛细胞比例也相应提高（图3（b）），这与Filipova等［12］在人成肌细胞C2C12 及Shimada 等［13］在人永生化视网膜色素上皮细胞hTERT-RPE1中获得的研究结果一致。这些结果证明电离辐射不仅能诱导正常细胞的初级纤毛发生，同样能促进肿瘤细胞初级纤毛发生，而电离辐射引起初级纤毛发生率的提高在正常细胞和肿瘤细胞中是否会产生相似的生物学效应是值得关注和研究的重要问题。

M059K 和M059J 是来源于同一神经胶质瘤患者 的DNA-PKcs （DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）基因状态不同的两种细胞系，M059K 为野生型，而M059J 为缺失型［23］。DNAPKcs 属于PIKK（Phosphoinositide-3-kinase-related protein kinase）家族，是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。PIKK家族是DNA损伤应答和修复的关键调节 因 子 ， 包 括 ATM （Ataxia-telangiectasia mutated）、 ATR （Ataxia-telangiectasia and Rad3-related）、DNA-PKcs 及mTOR（Mammalian target of rapamycin）等成员［24］。研究证实ATM、ATR及mTOR均是调控初级纤毛发生的重要因子［25-27］。本研究结果表明，DNA-PKcs 野生型细胞M059K 经电离辐射处理后初级纤毛发生率和长度均显著提高，而DNA-PKcs缺失型细胞M059J则无明显变化（图3（a））。此外，我们前期研究发现部分肿瘤细胞经电离辐射处理后发生G2期长期阻滞并进入衰老状态［28］，同时伴随着PIKK 家族下游因子Aurora A、Plk1 等周期调控蛋白的降解［29］，而Aurora A、Plk1 及KIF2 等的降解和激活与初级纤毛的发生及解聚直接相关［30-31］。因此，我们推测在神经胶质瘤细胞中DNA-PKcs同样是初级纤毛发生和延长所需要的，而电离辐射可能通过激活DNAPKcs 而影响下游Aurora A 和Plk1 等周期调控蛋白的活性，最终导致初级纤毛的发生和延长。

研究普遍认为DNA-PKcs 基因的缺失是造成M059J 细胞辐射敏感性远高于M059K 细胞的关键原因［32］。我们的结果提示初级纤毛发生率的差异同样影响两种细胞的辐射敏感性（图（1）、（2）），并且电离辐射处理时，M059K细胞的初级纤毛发生率进一步提高，而M059J 则无明显变化（图（3））。干扰初级纤毛发生能显著增强M059K的辐射敏感性（图4（c）），这些结果暗示初级纤毛及其相关的信号通路在调控细胞辐射应激响应及辐射敏感性进程中同样发挥着重要作用。值得关注的是，Hedgehog 通路的激活高度依赖于初级纤毛［33］，其下游靶基因涉及抗凋亡和激活自噬等多种促进细胞存活的功能［34］。由此推测电离辐射有可能通过促进M059K 细胞初级纤毛发生和延长而异常激活Hedgehog 通路，从而使细胞抵抗电离辐射引发的细胞凋亡提高了存活能力，但具体的机制仍需进一步探索和验证。

综上所述，本研究首次揭示了电离辐射影响人神经胶质瘤细胞初级纤毛发生的生物学现象，证明了初级纤毛具有调控肿瘤细胞辐射敏感性的生物学功能，为研究神经胶质瘤在内的肿瘤放疗抵抗的分子机制提供了新思路，同时为肿瘤放疗增敏提供了新靶点和理论依据。