双荧光素酶报告基因系统验证Nlu-miRNA-8对Ccdc124的靶向调控

闸雯俊，游艾青

（粮食作物种质创新与品种改良湖北省重点实验室/湖北省农业科学院粮食作物研究所，武汉 430064）

MicroRNA（即miRNA）是由18～25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA，它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA 3′UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5′端被称为种子序列的7 nt序列与位于靶mRNA 3′UTR的miRNA调控元件相互作用以识别靶mRNA。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，在生物学功能研究方面越来越受到人们的重视。

miRNAs研究已经成为昆虫生命科学领域中一个新的热点。国内已有研究者利用高通量测序获得雌 雄 成 虫 时 期 的 褐 飞 虱（Nilaparvata lugensStål）miRNAs，为研究miRNAs对褐飞虱生长发育提供了试验依据［1］。同时Zhou等［2］已经测得灰飞虱的miRNAs，为研究灰飞虱的代谢及发育奠定了基础。在雌性褐飞虱中，注射miR-4868b模拟物后谷氨酰胺合成酶蛋白表达下调，注射miR-4868b抑制剂后谷氨酰胺合成酶蛋白表达上调［3］。Nlu-miRNA-173及其靶标基因Ftz-F1的正常表达能够确保褐飞虱正常发育；而当Nlu-miRNA-173过表达时，会导致褐飞虱发生严重的蜕皮缺陷［4］。

褐飞虱属同翅目飞虱科昆虫，又称褐稻虱。褐飞虱是水稻主要害虫之一，在中国长江流域和华南及西南广大稻区发生频繁、危害严重［5］。为分析可能调控Ccdc124基因表达的miRNA，本研究构建了Ccdc124基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体psi-CHECK2并鉴定其与Nlu-miRNA-8靶向调控关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 褐飞虱品种（生物型Ⅱ）为武汉大学收藏，饲养在感虫水稻品种台中1号（TN1）植株上，环境条件为（25±2）℃，80%的相对湿度，光照培养16h/d，黑暗培养8 h/d。

1.1.2 试剂 人工合成的Ccdc124目标序列（生工生物工程股份有限公司合成），Nlu-miRNA-8 mimics及阴性对照（GenePharma合成）；DMEM培养基+10%FBS（Gbico）；XhoI和NotI（购自NEB公司）；DNA Ligation Kit（TOYOBO，货号：LGK-100）；转染试剂（lipofectamine 2000（Invitrogen，货号：11668-019）；QIAquick Gel Extraction Kit（QIA-GEN，货号：28704）；psi-CHECK2 Vector及双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega，货号：E1910）。

1.2 方法

1.2.1 褐飞虱组织总RNA提取与检测 使用Trizol试剂（购自Invitrogen公司）提取褐飞虱全虫的总RNA，具体提取步骤参照Trizol试剂自带说明书。溶解后的RNA在含有溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖胶上电泳检测，同时在RNA浓度测定仪上测定浓度，存放于-20℃备用。

1.2.2 褐飞虱Ccdc124基因3′UTR区片段的扩增根据GenBank中的褐飞虱Ccdc124基因序列（ID：XM_022350855.1）中 的3′UTR区 采 用Primer Premier5.0软件设计PCR引物，设计合 成 特 异 引 物（F：5′-CCGGCTCGAGCAAATCACCCGAGAACCCTA-3′；R：5′-TAAGCGGCCGCGCTATTGACAATGCTG ACCAA-3′），上述引物由广州市锐博生物科技有限公司合成。目标片段DNA大小为214 bp。PCR扩增反应体系（50μL）为5×Phusion Green HF Buffer 10μL，10 mmol/L dNTPs 1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，cDNA模板1μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH2O 32μL。反应程序为98℃预热30 s；98℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物进行1%琼脂糖电泳检测确定特异性产物。

1.2.3 PCR产物酶切和纯化 用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为40μL。PCR产物酶切体系：PCR产物20μL，10×H缓冲液4μL，BSA 4μL，XhoI限制性内切酶2μL，NotI限制性内切酶2μL，ddH2O 8μL，共40μL。反应程序为在37℃酶切4 h，随后进行回收纯化。

1.2.4 psi-CHECK2双酶切处理 psi-CHECK2载体含有限制性内切酶XhoI和NotI酶切位点。用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系总体积为40μL：载体psi-CHECK210μL，10×H缓冲液4μL，BSA 4μL，XhoI限制性内切酶2μL，NotI限制性内切酶2μL，ddH2O 18μL，共40μL。反应程序为在37℃酶切4 h，随后进行回收纯化。

1.2.5 双荧光素酶报告载体构建 T4 DNA Ligase连接目的片段与psi-CHECK2载体。将连接产物转化DH5感受态细胞，接种于含氨苄青霉素的LB平板，37℃生化培养箱过夜培养。筛选阳性克隆并经XhoI+NotI双酶切电泳鉴定。克隆经双酶切电泳鉴定后送测序（载体送至上海生工测序），与预期序列一致的克隆保留，接种LBAmp液体培养基培养12 h后提取质粒DNA。

1.2.6 双荧光素酶基因报告分析 果蝇S2细胞常规培养于37℃5%CO2饱和湿度的条件下。转染前1 d，细胞按2×104个/孔接种于24孔板上，培养基为含10%FBS的DMEM-高糖培养基；转染当天，细胞汇合度为50%～60%，吸去旧的培养基，用PBS洗涤2次，然后每孔加入300μL OPTI-MEM培养基，置于5%CO237℃培养箱中；每个孔OPTI-MEM培养基稀释Lipofectamine 2 000 1μL，终体积为50μL，室温下静置5 min；每个孔加入20μmol/L浓度的miRNA mimics 1μL和0.5μg质粒，再加入OPTI-MEM至总体积50μL，室温下静置5 min（最终孵育液中为50 nmol/L miRNA mimics）。复合50μL Lipofectamine 2 000倍稀释液和孵育液，室温下静置20 min；每孔加入100μL转染复合液，晃动24孔板稍加混匀；在5%CO237℃培养箱中孵育5 h，用新鲜的完全培养基（含血清）替换含有转染复合物的培养基；转染48 h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗2次，每孔细胞加入100μL的PLB（Passive lysis Buffer），室温轻微振摇15 min，收集细胞裂解液。用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910）进行样品Luciferase活性检测。

2 结果与分析

2.1 褐飞虱Ccdc124基因3′UTR区片段的扩增

以基因组DNA为模板进行PCR反应扩增Ccdc1243′UTR，约为214 bp，1.5%琼脂糖 凝胶电泳分析PCR产物大小，与预计产物大小一致（图1）。

图1 PCR扩增Ccdc124 3’UTR

2.2 Ccdc124 3′UTR载体构建

PCR产物和psiCHECKTM-2载体经双酶切、纯化、连接转化后挑取5个单克隆菌落培养过夜，菌液PCR鉴定（图2）。菌液PCR阳性单克隆，少量提取质粒后经双酶切鉴定，可见2条带（图3），结果显示分别对应Ccdc1243′UTR片段（214 bp）及载体片段（6 273 bp）。阳性克隆送测序鉴定，blast比对后与GeneBank公布序列一致，说明成功构建了psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体。

图2 菌液PCR鉴定电泳

图3 重组质粒psi-CHECK 2/Ccdc124 3′UTR双酶切鉴定电泳

2.3 miRNA-8与Ccdc124的靶点验证

将miRNA-8 minic（Minic-8）、空白对照（No-Minic）或阴性对照（Minic-Ct）与psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR重组质粒分别共转染果蝇S2细胞，以共转染空白对照（No-Minic）或阴性对照（Minic-Ct）作为对照组，测得共转染miRNA-8 minic（Minic-8）与psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR重组质粒组双荧光素酶相对值为0.625，与对照组相比，荧光素酶活性极显著下调37.5%。因此，根据双荧光素酶报告基因表达结果分析，miRNA-8 minic对psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体的报告荧光有明显的下调作用（图4）。

图4 双荧光素酶检测

3 小结与讨论

microRNA主要是通过与相应靶基因的3′UTR序列中microRNA作用元件相互作用，抑制靶基因mRNA的转录及蛋白的翻译。

本研究利用TargetScan、miRanda和Pictar 3种软件预测靶向调控Ccdc124的miRNA，并联合Pubmed文献数据库，最终认定Nlu-miRNA-8靶向调控Ccdc124基因的可能性较大。本课题通过生物学试验进一步验证了二者的调控关系。本研究以褐飞虱基因组DNA为模板PCR扩增Ccdc124基因的3′-UTR序列，构建psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体。试验设置空白对照、miRNA-8 minic阴性对照，设计严谨，联合构建的载体共转染于果蝇S2细胞，采用双荧光素酶基因报告法检测转染后各组活性。结果显示，转染miRNA-8 minic可明显下调psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体荧光酶素活性。综上所述，本研究成功构建含有Ccdc124基因3′-UTR段双荧光素酶基因报告载体，同时通过双荧光素酶基因报告分析法初步证明Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因在生物信息学水平存在调控的可能性，为下一步研究Nlu-miRNA-8的生物学功能提供可试验依据。