光动力疗法对黑色素瘤细胞迁移、侵袭的影响及作用机制△

张召力，李淑香

厦门市第五医院1皮肤科，2血透室，福建 厦门 361101

黑色素瘤是黑色素细胞恶变形成的，多见于皮肤，偶见于眼睛、鼻腔等部位，黑色素瘤起病初期可通过外科手术治疗方式将其切除，但若干预、治疗不及时，黑色素瘤细胞将会发生迁移和侵袭，依靠现有的医疗手段，治疗效果往往难以达到预期，生存率普遍不高。因此，抑制黑色素瘤的迁移和侵袭是提高黑色素瘤患者生存率的关键。光动力疗法属于微创疗法，临床常将其应用于非黑色素性皮肤癌的治疗中，且均取得了理想的治疗效果。有报道显示，光动力疗法可通过抑制核因子κB 信号通路达到促进肿瘤细胞凋亡的目的，继而抑制细胞恶变。然而经查阅文献发现，有关光动力疗法治疗黑色素瘤的研究并不多见，且研究结论尚未统一。鉴于此，本研究探讨了光动力疗法对黑色素瘤细胞迁移、侵袭的影响及作用机制，旨在为黑色素瘤患者的治疗开辟新的思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

溶媒：灭菌注射用水、生理盐水。肿瘤细胞株：黑色素瘤细胞株B16-F10购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；羊胚素：每瓶25 mg。二甲基亚砜、胰蛋白酶、培养基与胎牛血清均购自美国Sigma公司，二喹啉甲酸试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；破膜液购自武汉博士德生物工程有限公司，流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；Ki-67抗体、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）抗体均购自英国Abcam 公司。研究涉及的所有材料均在有效期内，且仪器的使用均由专业人员在严格质控下完成。

1.2 黑色素瘤细胞B16-F10 的培养

复苏黑色素瘤细胞B16-F10，将其置于含有10%胎牛血清与青霉素的高糖培养基中，在5%CO、37 ℃培养箱中培养，当细胞生长至融合度约为90%时进行传代，每3 天传代一次，传代时使用0.25%胰蛋白酶细胞消化液进行处理。

1.3 细胞划痕实验检测黑色素瘤细胞B16-F10 的迁移能力

选取生长至对数期的黑色素瘤细胞B16-F10，经胰蛋白酶消化处理后接种在六孔板内，并在每个孔中加入2 ml 细胞悬液继续培养1 天。当细胞融合度≥80%时，孵育光敏剂，给予1 mmol/L 5-氨基酮戊酸，2 h 后给予635 nm 红光照射治疗，能量分别为0 J（A 组）、2.4 J（B 组）、4.8 J（C 组），以未进行红光照射的细胞作为对照组。然后采用1 ml 移液枪枪头垂直于培养板划“一”字划痕，之后加入胎牛血清，再次放入培养箱，光动力疗法的时间为24 h，通过显微镜下拍摄的照片观察并比较细胞迁移情况。采用Image J 定量评估划痕愈合率，划痕愈合率=（0 h 划痕面积-24 h 划痕面积）/24 h 划痕面积×100%。对照组不给予任何干预。

1.4 Transwell 实验检测黑色素瘤细胞B16-F10 的侵袭能力

将预先在Transwell 上室内平铺好的Matrigel胶放在37 ℃培养箱中聚合2 h，与迁移能力检测方法相同，进行孔内培养、孵育、光照，制成单细胞悬液后，将其培养在含有1%胎牛血清的培养基中，并调整细胞密度为1×10/ml，在Transwell 下室中加入培养基（含胎牛血清），并在下室中铺入制好的细胞悬液，恒温（37 ℃）培养1 天，然后采用0.5%结晶紫对上室底部的细胞染色，显微镜下观察并记录细胞数量。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测迁移和侵袭相关蛋白的相对表达量

采用RIPA 裂解液提取各组细胞中的蛋白，并采用二喹啉甲酸试剂盒检测蛋白浓度，各组分别选取40 μg 蛋白，采用10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，采用半干法将分离后的目标蛋白转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，应用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后加入适宜浓度的一抗（Ki-67 抗体的稀释比例为1∶100，VEGF 抗体的稀释比例为1∶1000，MMP9 抗体的稀释比例为1∶800），4 ℃孵育过夜，次日取出PVDF 膜，洗去膜上未结合的一抗，加入二抗37 ℃孵育1 h 后，滴加化学发光显色液进行曝光显影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，计算Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 光动力疗法对黑色素瘤细胞B16-F10 迁移、侵袭的影响

细胞划痕实验和Transwell 实验结果显示，对照组、A 组、B 组、C 组的划痕愈合率和侵袭细胞数目比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。A 组、B组、C 组的划痕愈合率和侵袭细胞数目均低于对照组，B 组、C 组的划痕愈合率和侵袭细胞数目均低于A 组，C 组的划痕愈合率和侵袭细胞数目均低于B 组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 不同组别黑色素瘤细胞B16-F10 划痕愈合率和侵袭细胞数目的比较（±s）

2.2 光动力疗法对黑色素瘤细胞B16-F10 中迁移和侵袭相关蛋白相对表达量的影响

对照组、A 组、B 组、C 组黑色素瘤细胞B16-F10 中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。A 组、B 组、C组中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量均低于对照组，B 组、C 组中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量均低于A 组，C 组中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量均低于B 组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同组别黑色素瘤细胞B16-F10中迁移和侵袭相关蛋白相对表达量的比较（±s）

3 讨论

研究显示，绝大多数皮肤癌患者死亡的直接原因为黑色素瘤，尽管黑色素瘤仅占皮肤癌的5%左右，且早期黑色素瘤患者可通过外科手术治疗，但术后复发率高一直是临床尚未攻克的难题，进展期黑色素瘤患者的预后更不理想，病死率居高不下，其根本原因在于细胞增殖与凋亡受到抑制，因此治疗黑色素瘤的根本在于抑制黑色素瘤细胞的异常增殖或促进黑色素瘤细胞凋亡。

光动力疗法是近年来新兴的肿瘤治疗方法，其原理如下：使局部细胞摄取光敏剂并视情况给予光照射，在氧分子与光敏剂的协同作用下，发生氧化损伤，造成靶细胞坏死、凋亡，诱发炎症免疫反应。光动力疗法在发挥促进肿瘤细胞凋亡作用的同时，对正常的组织细胞几乎不会造成影响，因此临床对皮肤癌、食管癌等恶性肿瘤的治疗时均会开展光动力疗法。众所周知，迁移和侵袭是肿瘤病灶重要的恶性生物学特征之一，这一过程尤为繁杂，包括原发性肿瘤血管产生，肿瘤细胞脱落后侵袭邻近组织的基底膜、细胞外基质，通过全身循环转移至其他部位进行生长。其中肿瘤血管生成是促进肿瘤细胞增殖与转移的关键，VEGF 是促血管生成因子，当其与受体结合后，可使内皮细胞增殖与分泌增多，大量细胞基质被降解，加速血管腔形成的同时促进细胞增殖、侵袭。Ki-67 是一种与细胞增殖密切相关的抗原，Ki-67 的表达水平可直接反映细胞的增殖活性，因此临床常将其作为黑色素瘤患者预后的评估指标之一。研究表明，MMP9 在肿瘤迁移和侵袭的过程中至关重要，其主要的生物学作用是降解细胞外基质，当机体内基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）与金属蛋白酶组织抑制剂之间的平衡被打破时，细胞外基质的异常代谢产物将是肿瘤细胞转移的重要促进因子。本研究结果显示，对照组、A 组、B 组、C 组的划痕愈合率和侵袭细胞数目比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01），其中C 组的划痕愈合率和侵袭细胞数目均最低，然后由低至高依次为B 组、A 组、对照组，表明光动力疗法可抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力。此外，本研究结果还显示，对照组、A 组、B 组、C 组黑色素瘤细胞B16-F10 中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01），其中C 组中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相对表达量均最低，然后由低至高依次为B 组、A 组、对照组，提示光动力疗法可抑制黑色素瘤细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达水平。鉴于此，考虑在黑色素瘤患者的临床治疗中可开展光动力疗法，旨在延缓疾病进程，最大程度地促进患者获得良好预后。但因此类研究较少见，且本研究结果无较多循证医学证据作为支持，故本研究结果的真实性、可靠性还需在未来开展大量前瞻性、大样本量的研究加以验证。

综上所述，光动力疗法可明显抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭，临床可考虑将光动力疗法作为提高黑色素瘤治疗效果、促进患者获得良好预后的重要方法。