宠物猫细小病毒XNF-1株分离鉴定及VP2基因遗传变异分析

蒋含伟，解秀梅*，祁天荣，李雪梅

(1.青海畜牧兽医职业技术学院，青海湟源 812100；2.佰汇缘宠物医院，青海西宁 810001；3.青海省畜牧兽医科学院，青海西宁 810016)

猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)主要感染猫科、鼬科等多种动物，该病毒是肉食兽细小病毒属中感染范围最广、致病性最强的病原，其病死率和感染率均较高，1984年我国首次分离得FPV后，随后在我国不断发生与流行，该病严重威胁我国宠物及野生猫科动物的健康[1-3]。猫细小病毒可以感染不同阶段的猫，以3月龄～5月龄的幼猫易感，被感染的动物以高热、呕吐、腹泻、急性肠炎、泛白细胞减少症为主要临床症状，该病毒又称为猫泛白细胞减少症病毒。宠物猫主要通过注射五联、六联等多联疫苗进行预防，宠物猫的感染率可达70%以上，其病死率为50%以上，对宠物猫的健康养殖带来了严重的影响[4-6]。FPV为单股的DNA病毒，且无囊膜，其病毒粒子直径约在20 nm～24 nm之间，呈20面体对称结构。FPV基因组中主要编码结构蛋白(capsid protein 1,VP1)、(capsid protein 2，VP2)和非结构蛋白(nonstructural protein 1,NS1)、(nonstructural protein 2,NS2)，其中结构蛋白中的VP2蛋白主要决定FPV病毒的血凝活性，同时该蛋白可诱导动物机体产生中和抗体，起到自我保护作用，具有装配病毒样颗粒的能力，VP2蛋白对该病毒的复制及感染宿主的范围具有一定的决定作用[7-8]。因此，分析VP2基因的遗传变异具有一定意义。

2020年4月，从佰汇缘宠物医院就诊的疑似宠物猫FPV感染病例，采集患病宠物的粪便、血清等病料进行FPV分离，得到1株FPV，命名为XNF-1株，用PCR对分离的FPV流行株的VP2基因进行克隆、测序并分析其序列遗传变异情况，为宠物猫FPV的防控及疫苗研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2020年4月，佰汇缘宠物医院就诊的疑似宠物猫FPV感染病例，该病宠物猫未经FPV疫苗免疫，出现呕吐、腹泻等现象，FPV胶体金试纸条检测为阳性，采集粪便、血清等病料经处理接种猫肾传代细胞，进行病毒分离。

1.1.2 主要试剂 猫肾传代细胞(CRFK)、猫FPV阳性血清、FITC标记山羊抗鼠抗体均购自中国兽医药品监察所;CRFK由青海畜牧兽医职业技术学院动物疾病检测中心传代保存；病毒DNA提取试剂盒，TaKaRa公司产品；6孔、96孔细胞培养板、细胞培养瓶、胎牛血清、DMEM培养基、青链霉素双抗，美国Gibco公司产品；18T载体、ExTaqDNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA Marker DL 2 000，北京中科瑞泰生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 恒温水浴锅(LHH-4型)，常州金坛良友仪器有限公司产品；二氧化碳恒温培养箱(DHP-9092),上海恒一仪器制造有限公司产品；梯度PCR仪(G5150),美国 Agilent Technologie 公司产品；电泳仪(DYY-8C型)，北京六一生物科技有限公司产品；荧光倒置显微镜(4342型)，西尼科光学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 采集疑似宠物猫FPV粪便、血清等病料加入无菌的适量的PBS制成混悬液，置-80℃反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，取上清过滤除菌，加入双抗后，置-80℃低温冰箱保存备用。

1.2.2 分离培养 从液氮中取出CRFK细胞后，37℃室温解冻，加入细胞瓶中扩大培养后，分到6孔细胞培养板中培养，将上述病料处理的上清按照1/10的比例接种到CRFK置 于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，未经接种上清的病料细胞为空白对照，每日观察细胞状态。盲传至4代～5代，接毒CRFK细胞3 d出现80%的细胞病变后收毒，反复冻融后3次，置-80℃低温冰箱保存备用。

1.2.3 形态学观察 参考文献[9]方法，取出现典型细胞病变的CRFK细胞进行收毒，离心取上清，用20 g/L的磷钨酸负染后电镜观察其形态学。

1.2.4 病毒的PCR鉴定 参考文献[10]，参照GenBank中FPV基因组序列，设计FPV鉴定引物，F:5′-GGATGGGTGGAAATCACAGC-3′，R:5′-ATAACCAACCTCAGCTGGTC-3′，扩增片段大小为845 bp。用病毒DNA提取试剂盒提取CRFK细胞培养物基因组DNA，用鉴定引物进行PCR鉴定，回收目的基因片段，连接到18T载体上，挑取阳性菌落，提取质粒进行测序。

1.2.5 间接免疫荧光试验鉴定 参考文献[11]方法，对PCR检测FPV为阳性的细胞培养物进行间接免疫荧光试验鉴定。

1.2.6 动物致病性试验 参照文献[12]方法，选择4只60日龄的健康的试验猫(FPV胶体金试纸条、ELISA试剂盒检测FPV为阴性)，攻毒组2只试验猫口服病毒混悬液2 mL，对照组给予等量的PBS，攻毒组2只试验猫隔离饲养，每日观察试验猫的发病情况，攻毒后第4天开始收集粪便进行病毒鉴定。

1.2.7 病毒的VP2基因PCR扩增与序列分析 参考文献[13]，参照GenBank中FPV基因序列，设计VP2基因引物，F:5′-TGTAACTCAAATGGGAATGGAAATA-3′，R:5′-ATAACAACAACAATAGTTAG-3′，片段大小为1 078 bp。对XNF-1株进行PCR鉴定，回收目的基因片段，连接到18T载体上，挑取阳性菌落，提取质粒进行测序。XNF-1株的测序结果与GenBank中登录的FPV参考株进行同源比对，构建系统进化发育树，分析XNF-1株的VP2基因遗传变异特点。

2 结果

2.1 病毒分离鉴定结果

将采集的粪便、血清等病料组织经处理后，接种于CRFK细胞中进行病毒分离培养，感染组的CRFK细胞在盲传6代时出现CPE，CRFK细胞出现了萎缩、聚堆、脱落、个别的细胞出现肿胀、变形等(图1)，将分离毒株命名为XNF-1株。未感染组的CRFK细胞未见明显的病变(图2)，XNF-1株在电子显微镜下可见观察无囊膜的、圆形的、直径大约23 nm的病毒粒子(图3)，与报道的FPV形态学结构基本相似。XNF-1株初步判定为FPV。

图1 接毒XNF-1株后CRFK细胞形态(40×)

图2 未接毒的CRFK细胞形态(40×)

图3 XNF-1株负染病毒粒子形态

2.2 病毒PCR鉴定结果

用病毒DNA提取试剂盒提取CRFK细胞培养物基因组DNA，用FPV鉴定引物进行PCR鉴定，XNF-1株的细胞培养物扩增出大约为845 bp目的条带(图4)。 XNF-1株的测序结果与与GenBank中登录的FPV参考株同源性在97.5%～99.8%之间。XNF-1株PCR鉴定为FPV。

M.DNA标准DL 2 000；1～7.XNF-1株的细胞培养物; 8.空白对照

2.3 病毒间接免疫荧光(IFA)检测结果

将XNF-1株的细胞培养物按4%的比例接种到CRFK细胞，设立对照组，置于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养36 h～48 h进行进行间接免疫荧光试验检测，用倒置荧光显微镜可以观察接种XNF-1株的CRFK细胞。结果显示， 感染组的CRFK细胞呈现特异性绿色荧光(图5)，对照组的CRFK细胞未见有特异性绿色荧光(图6)。

图5 XNF-1株IFA检测结果(200×)

图6 对照组CRFK细胞(200×)

2.4 动物致病性试验结果

攻毒试验组的猫在攻毒后的第5天开始出现精神萎靡，食欲减退，严重腹泻伴有呕吐、排出恶臭的稀便、脱水，在试验的第10天，攻毒试验组的2只试验猫死亡，经FPV胶体金试纸条检测血清为阳性，PCR检测感染组猫粪便FPV阳性。对照组猫中未见任何异常，说明XNF-1株对猫具有致病性。

2.5 病毒的VP2基因与序列分析

用PCR方法对分离的XNF-1株的VP2基因进行扩增，结果显示，XNF-1株增出大约为1 078 bp目的条带，与预期大小相符(图7)。XNF-1株的VP2基因测序结果与GenBank中登录的10株FPV/CPV及6株参考株序列核苷酸序列的同源性在98.1%～99.9%之间。利用DNA Star软件构建系统进化发育树，并分析XNF-1株的VP2基因遗传变异特点(图8)。结果显示，XNF-1株与FPV-C株、 FPV-D株、FPV-A株、FPV-B株、FPV-E株、FPV-USA株位于同一分支，遗传距离较近，其同源性在99.2%～99.9%之间，与FPV-C株、 FPV-D株、FPV-A株位于同一分支，与FPV-A株位于同一分支，遗传距离最近。XNF-1株与其他参考株相比同源性较远通过对分离的XNF-1株与16株参考毒株对比， XNF-1株的VP2基因序列中只是个别碱基发生变化，编码的氨基酸未发生缺失，说明分离的XNF-1株未发生明显变异。

M.DNA标准DL 2 000；1.XNF-1M.DNA Marker DL 2 000; 1.XNF-1 strain

图8 XNF-1株的VP2基因基因序列的进化树结果

3 讨论

猫细小病毒(FPV)是危害猫科、鼬科等多种动物的主要病毒性疾病之一，该病对幼猫极易感，且具有发病急、传播性快、病死率高的特点，对猫科及野生肉食动物的健康养殖具有较大的威胁。国内外相关研究表明，FPV在世界各地区广泛分布流行，在我国的多个省区广泛流行，从死亡的猫、虎、浣熊等多种野生动物分离到FPV[13-15]。因此，加强FPV流行监测，减少该病的发生与流行具有重要的意义。猫细小病毒(FPV)损伤动物机体的免疫系统，破坏其单核细胞和巨噬细胞，尤其是使白细胞减少，造成机体免疫力下降，引发其他相关疾病[16-17]。本试验从疑似宠物猫FPV粪便、血清等病料中分离得到1株病毒，命名为XNF-1株，经过鉴定为FPV，通过致病性试验对猫具有很强的致病。因此，对分离的XNF-1株的VP2基因进行PCR扩增，分析其遗传变异情况。

本研究分离的XNF-1株的VP2基因测序结果与GenBank中登录的10 株FPV/CPV及 6 株VP2蛋白参考株序列核苷酸序列的同源性在 98.1%～99.9%之间。且与FPV-C株、 FPV-D株、FPV-A株位于同一支，与FPV-A株位于同一分支，遗传距离最近。与其他参考株相比同源性较远。分离的XNF-1株VP2基因序列编码的氨基酸未发生缺失，只是个别碱基发生变化，从而说明分离的XNF-1株未发生明显变异。张雪竹等[8]报道了从吉林农业大学动物医院分离的FPV的VP2基因与分离株AB054226(日本)、KX900570(长春)株亲缘关系较近。刘琪等[9]分离的PLVBJO4株VP2基因与2017年意大利分离株位于同一分支,与其他分离株亲缘性远。本试验与上述报道存在一定差异性，可能与地区有关。猫细小病毒目前没有特效药物进行治疗，主要通过多联苗进行免疫预防该病发生，临床中经常出现免疫失败，引起动物发病。因此，应该注意该病防控，尤其是宠物猫制定出有效免疫程序，定期检定，才能有效控制宠物FPV的发生与流行。本研究为宠物猫细小病毒病防控及疫苗研究奠定了基础。