榆林市某陕北白绒山羊场羊腹泻病因分析

翟军军，米耀云，李镕涛，冯 平，张 艳*

(1.榆林学院陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，陕西榆林 719000；2.榆林学院生命科学学院，陕西榆林 719000；3.榆阳区动物疫病预防控制中心，陕西榆林 719000)

羔羊腹泻一直是困扰陕北地区甚至全国养羊业发展的重要疾病之一。随着陕北地区养羊模式由天然放牧到集约化饲养转变，养殖规模化程度越来越高，羔羊腹泻在陕北地区呈现上升趋势。在产羔季节，如果饲养管理、产羔护理和疾病防控工作不到位，就可能引起羔羊大批发病[1]，给羊场或养羊户造成严重经济损失，严重制约了农牧民脱贫致富的进程，因此，羔羊腹泻病越来越受到人们的关注。

引起羔羊腹泻的病原包括细菌、病毒和寄生虫等，最常见的细菌包括致病性大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和沙门氏菌(Salmonella)等；病毒性病原包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)[2]、羊库布病毒(Ovine Kobuvirus，OKoV)[3]、羊肠道病毒(Caprine enteroviruses，CEV)[4]、羊冠状病毒(Coronavirus，CoVs)[5]、诺如病毒(Norovirus，NoV)[6]、羊札幌病毒(Sapovirus，SV)和轮状病毒(Rotavirus，RV)[7]等；寄生虫包括艾美耳球虫(Eimeria)、隐孢子虫(Cryptosporidium)[7]等。

在养羊业生产中，由于养殖户的错误认识，一旦发生腹泻，就立即使用抗生素进行治疗，效果不佳后才会寻求专业人员帮助，该羊场也是如此，抗生素治疗1周没有效果，怀疑为其他类型病原感染所致。为了明确该羊场腹泻的主要病原，结合该羊场实际情况，本研究拟采用PCR和饱和盐水漂浮法对腹泻样品分别进行病毒和寄生虫检测，以确定本场此次腹泻的主要病因，为控制该羊场腹泻提供技术指导，也为榆林市进一步研究、防控陕北绒山羊腹泻病提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 90份陕北绒山羊腹泻样品，其中2月龄～3月龄羔羊粪便样品15份，6月龄～7月龄羔羊粪便样品45份，成年羊粪便样品30份，将样品密封标号，置4℃保存备用。

1.1.2 主要试剂TaqPCR预混试剂Ⅱ，天根生化科技(北京)有限公司产品；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，宝日医生物技术(北京)有限公司产品；粪便RNA提取试剂盒，美国Omega公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 倒置相差显微镜(TS100-F)，苏州景通仪器有限公司产品；离心机(TDL-5A)，上海菲恰尔分析仪器有限公司产品；数码显微镜(BA400)，麦克奥曲实业集团有限公司产品；离心机(5424)、梯度PCR仪(6325)，Eppendorf公司产品；培养箱(HF90)，上海力申科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 参照文献[8-14]BVDV、OKoV、CEV、CoVs、NoV、SV和RV基因设计特异性引物(表1)，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA提取、RT-PCR鉴定 按照粪便RNA提取试剂盒说明书提取腹泻样本的RNA，然后按照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录合成cDNA，以反转录产物作为模板，利用上述引物进行病毒核酸检测，具体体系为：内含2×DNA预混酶10 μL，β-actin上、下游引物各0.5 μL，病毒上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，水7 μL，总体积20 μL。PCR扩增程序：94℃ 3 min；95℃ 30 s，95℃ 30 s，退火按照表1中的温度，30 s，72℃ 30 s，共35个循环；最后72℃ 5 min。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 引物信息

1.2.3 粪便寄生虫检查 利用饱和食盐水漂浮法分别对2月龄～3月龄、6月龄～7月龄和成年羊的新鲜粪便样品进行寄生虫检查，计算球虫感染率。利用司陶尔虫卵计数法分别对2月龄～3月龄、6月龄～7月龄和成年羊的新鲜粪便样品进行球虫感染强度检测，感染强度是指每克粪便样品中所感染的球虫卵囊总数。

1.2.4 卵囊的分离与培养 将粪便样品放入100 mL烧杯中，加入1倍体积的蒸馏水搅拌捣碎，再加入4倍体积的蒸馏水搅拌过滤；3 000 r/min离心10 min，弃上清液取沉淀，加入5倍体积的饱和食盐水，混匀；3 000 r/min离心10 min，取上清液1/3～1/2于洁净的烧杯中，加入5倍体积的蒸馏水，混匀；3 000 r/min离心10 min，沉淀即为羊球虫卵囊，将其按照文献[15]进行孢子化。

1.2.5 球虫种类鉴定 参照文献[16-18]对观察到的卵囊进行种类鉴定，观察100个孢子化卵囊，记录各种卵囊数量并计算各种卵囊所占的百分比。

2 结果

2.1 病毒核酸检测结果

病毒核酸检测结果见图1。利用BVDV、OKoV、CEV、CoVs、Norovirus、Sapovirus和RV特异性引物，并以β-actin作为内参，进行病毒核酸检测，15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测显示，BVDV、OKoV、CEV、CoVs、NoV、SV和RV核酸均为阴性。

M.DNA标准DL 2 000;1.阴性对照；2.牛病毒性腹泻/黏膜病病毒；3.羊库布病毒；4.羊肠道病毒；5.冠状病毒；6.诺如病毒；7.羊札幌病毒；8.轮状病毒

2.2 球虫感染率及感染强度

90份样品粪便样品只检测到球虫卵囊，其中2月龄～3月龄的感染率为100%(15/15)，6月龄～7月龄的感染率为95.6%(43/45)，成年羊的感染率为63.3%(19/30)，综合感染率为85.6%(77/90)。司陶尔虫卵计数法检测结果显示，3个不同年龄段山羊球虫的感染强大差异较大，其中2月龄～3月龄的感染强度为25 393 OPG，6月龄～7月龄的感染强度为2 800 OPG；成年羊的感染强度为1 200 OPG，该羊场陕北白绒山羊球虫平均感染强度为9 798 OPG。

2.3 球虫种类鉴定及各虫种感染率

结果见表2。共检出13种艾美耳球虫，分别为约奇艾美耳球虫(E.jolchijevi)、羊艾美耳球虫(E.caprovina)、颗粒艾美耳球虫(E.granulosa)、家山羊艾美耳球虫(E.hirer)、阿沙塔艾美耳球虫(E.ahsata)、阿氏艾美耳球虫(E.arlongi)、山羊艾美耳球虫(E.caprina)、克氏艾美耳球虫(E.christenseni)、艾丽艾美耳球虫(E.alijevi)、小型艾美耳球虫(E.parva)、斑点艾美耳球虫(E.puncatata)、错乱艾美耳球虫(E.intricata)、柯氏艾美耳球虫(E.kocharli)。2月龄～3月龄羔羊共发现13种球虫，优势种为颗粒艾美耳球虫(17%)和克氏艾美耳球虫(18%)、6月龄～7月龄育成羊发现11种球虫，优势种为山羊艾美耳球虫(22%)和家山羊艾美耳球虫(14%)、成年羊的10种球虫，优势种为阿氏艾美耳球虫(21%)、克氏艾美耳球虫(17%)和颗粒艾美耳球虫(17%)。

表2 不同年龄段绒山羊感染各类球虫所占比例(n=100)

2.4 球虫孢子化培养及生物学特征

本研究共检出13种艾美耳球虫，各种类球虫卵囊孢子化的形态见图2，现将优势种的卵囊形态描述如下。

A.约奇艾美耳球虫；B.羊艾美耳球虫；C.颗粒艾美耳球虫；D.家山羊艾美耳球虫；E.阿沙塔艾美耳球虫；F.阿氏艾美耳球虫；G.山羊艾美耳球虫；H.克氏艾美耳球虫；I.艾丽艾美耳球虫；J.小型艾美耳球虫；K.斑点艾美耳球虫；L.错乱艾美耳球虫；M.柯氏艾美耳球虫

颗粒艾美耳球虫(E.granulosa)的卵囊呈倒卵圆型，大小平均为33.25 μm×23.05 μm，形状指数1.44，有极帽，有卵膜孔，无残体，有斯氏体，孢子囊呈中型卵圆形，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中，孢子化时间60 h～72 h。

家山羊艾美耳球虫(E.hirer)的卵囊呈椭圆形，大小平均为24.1 μm×18.5 μm，形状指数1.30，有极帽，有卵膜孔，有极粒，有内残体，无外残体，有斯氏体，孢子囊呈中型卵圆形，子孢子头尾相邻横列于孢子囊中，孢子化时间36 h～60 h。

阿氏艾美耳球虫(E.arlongi)的卵囊呈卵圆形，大小平均为30.2 μm×22.5 μm，形状指数1.42，有极帽且极帽明显，有卵膜孔，有内残体，有数个极粒，孢子囊呈中大型的长卵圆形，子孢子呈鱼形，头尾并列，孢子化时间36 h。

山羊艾美耳球虫(E.caprina)的卵囊呈长椭圆形，大小平均为33.5 μm×23.9 μm，形状指数1.40，无极帽，有卵膜孔，孔下有褶皱，有内残体，无外残体，极粒数量多，孢子囊呈中型卵圆形，子孢子头尾相邻并列于孢子囊内，孢子化时间72 h。

克氏艾美耳球虫(E.christenseni)的卵囊呈卵圆形，大小平均为36.4 μm×24.4 μm，形状指数1.49，有极帽和卵膜孔，有内残体，无外残体，有极粒，孢子囊呈中型长卵圆形，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中，孢子化时间72 h～96 h。

3 讨论

感染性腹泻是我国动物传染病中(尤其是幼龄动物)发病率最高、流行最广、危害性最大的一类疫病，该病多发生于饲养管理差、环境温度骤变和突然更换饲料等情况下，临床上细菌性腹泻早已受到高度重视，但是病毒性腹泻和寄生虫性腹泻往往被忽视。Dahmani H等[7]对来自阿尔及利亚中北部地区30个羊圈的559只新生羔羊的粪便样本进行病原特异性抗原ELISA检测，小细小隐孢子虫感染率为58.81%(312/559)、大肠埃希氏菌K99是27.72%(155/559)、轮状病毒12.88%(72/559)和冠状病毒3.57%(17/559)。Mi R等[19]对中国10个省份16个农场的绵羊粪便样本检测发现，隐孢子虫总阳性率为28.5%(295/1 035)，种类分布因省份和农场而异，且在羔羊和成年绵羊中检测到，断奶后羔羊中感染率最高。Shabana I I等[20]对来自沙特阿拉伯麦地那地区腹泻的绵羊和山羊调查发现，大肠埃希氏菌的感染率分别为34.7%和30.7%。轮状病毒的感染率分别为31.6%和27.4%，冠状病毒的感染率分别为19.6%和16.2%。均为混合感染，轮状病毒感染与产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)感染显著相关。因此，在养羊业生产中，为了科学合理的预防和治疗腹泻，避免盲目滥用抗生素，必须加强腹泻病原，尤其是病毒和寄生虫的实验室检测。

在畜牧业生产中，肠道疾病会造成严重的经济损失，病死率增加、生长抑制和转化率降低。艾美耳球虫引起的球虫病是一种高发病率的寄生虫病，且经常是多种球虫的混合感染，Trejo-Huitrón G等[21]对墨西哥东南部地区绵羊球虫调查，共鉴定出11种艾美耳球虫，而且约有80%羊属于多种球虫的混合感染，Al-Neama R T等[22]对英国西北部两个绵羊场连续跟踪调查24个月，发现多数动物至少感染10种不同艾美耳球虫，其中巴库艾美耳球虫和卵形艾美耳球虫最为常见，同时还发现弯曲菌的感染与否能够明显影响艾美耳球虫感染的强度。在本研究中，2月龄～3月龄羔羊共发现13种球虫，6月龄～7月龄育成羊发现11种球虫，成年羊发现10种球虫，且也多为混合感染。

此外，de Macedo L O等[23]通过单因素分析和逻辑回归评估危险因素发现，山羊的球虫感染与羊群规模、饲养方式、饲喂地点、饲粮中有无矿物盐、牧场地形地貌和消毒周期等因素有关。对于绵羊而言，群体大小和饲养方式是影响球虫感染最重要的因素，因此，在预防羊球虫病时应该充分考虑上述因素。