致母猪子宫内膜炎金黄色葡萄球菌鉴定及致病性与耐药性检测

李宝红，凌欣华，辛海云，涂 柯，李剑豪*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州 510640；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东茂名 525000；3.梅州市农林科学院动物科学研究所，广州梅州 514021)

母猪子宫内膜炎是由外界的多种致病微生物入侵母猪子宫黏膜层中，在其黏膜层中定植、生长及繁殖后引起黏液性或化脓性炎症等，该病是母猪生产中常见的繁殖障碍疾病之一[1]。母猪子宫内膜炎的发病率呈现上升趋势，该病主要引起母猪的不孕不育、繁殖能力下降等，以慢性子宫内膜炎的发病率最高[2-3]。母猪子宫内膜炎主要由金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌等病原菌引起的，其中金黄色葡萄球菌是引起母猪子宫内膜炎的主要病原菌[4-6]。

金黄色葡萄球菌是临床中常见的人兽共患病原菌之一，该菌广泛分布于空气、土壤、食品中等，该菌可以引起多种动物和人发病，临床以败血症、化脓性感染、心内膜炎、乳房炎、子宫内膜炎等常见[7-8]。国内关于金黄色葡萄球菌引起牛乳房炎、子宫内膜炎的报道较多，但是引起猪子宫内膜炎的报道较少。本研究从2018年-2020年采集患子宫内膜炎母猪的子宫化脓性分泌物样品177份进行金黄色葡萄球菌分离鉴定，对其致病性、血清型及耐药性进行检测，为该地区规模化猪场子宫内膜炎金黄色葡萄球菌的防控提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料样品来源 2018年-2020年，从广州地区规模化猪场中采集经临床诊断患有子宫内膜炎，且化脓症状明显的母猪子宫化脓性分泌物177份。

1.1.2 实验动物 25 g左右的健康昆明系母鼠480只，均购于南方医科大学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂 甘露醇氯化钠培养基，广东环凯微生物科技有限公司产品；营养肉汤，青岛海博生物科技有限公司产品； Raid ID 32 STREP阳性菌鉴定试条，法国梅里埃公司产品；临床中常用的药敏纸片，北京天坛药物生物技术开发公司产品； DNA标准DL 2 000，大连普肽生物科技有限公司产品；2×TaqMarker Mix，北京索莱宝生物科技有限公司产品;70 mL/L绵羊血培养基，广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室自制。

1.1.4 主要仪器 全自动细菌生化鉴定系统，法国梅里埃公司产品；多功能PCR仪、凝胶成像仪，Thermo Fisher公司产品；双人超净工作台，博科(BIOBASE)公司产品；恒温培养箱，芜湖华测仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 将采集样品接种于70 mL/L绵羊血培养基上进行扩大培养，挑取典型单个菌落接种于甘露醇氯化钠培养基上在37 ℃恒温培养箱中进行鉴别培养12 h～18 h，纯化培养后进行革兰氏染色，显微镜观察菌株的形态。

1.2.2 细菌生化鉴定 分离菌株的生化鉴定试验按照Raid ID 32 STREP阳性菌鉴定试纸条说明书进行。

1.2.3 细菌的PCR鉴定 参考文献[9]，设计金黄色葡萄球菌特异鉴定引物femB，5′-TCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，5′-GTGGGGGTGAGTAA-3′，扩增片段大小为651 bp。用水煮法提取分离菌株基因DNA，用梯度PCR进行鉴定， 回收PCR产物送华大基因公司测序，测序结果用BLAST进行同源性对比。

1.2.4 致病性试验 参考文献[10]的方法，将临床分离的菌株培养至对数期计数(108CFU/mL)，每株分离菌株阴道注射5只小鼠，剂量为0.25 mL，对照组注射等量生理盐水，观察6 d，观察其发病及死亡情况。

1.2.5 细菌血清鉴定 采用PCR对临床中分离的金黄色葡萄球菌进行血清型鉴定。参考文献[11]，设计金黄色葡萄球菌血清型鉴定引物荚膜多糖5型和8型引物序列(表1)，由华大基因公司合成，已提取的分离菌株的基因DNA为模板PCR进行鉴定。

表1 血清型鉴定引物序列

1.2.6 药敏试验 临床中分离菌株的药敏试验参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2017年推荐的标准K-B纸片法进行试验和结果判定，进行耐药性分析。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

分离菌株在70 mL/L脱纤绵羊血培养基呈现β溶血菌落；在甘露醇氯化钠琼脂培养基上长出浅黄色菌落；染色镜检可见单个短链和成堆的葡萄串状排列的阳性球菌。经生化试验鉴定结果显示，96株分离菌株初步鉴定为金黄色葡萄球菌。分离菌株的培养特性、形态学及生化鉴定与《伯杰氏细菌鉴定手册》金黄色葡萄球菌培养特性、形态学及生化特性基本上一致。

2.2 细菌的PCR鉴定结果

初步鉴定的96株金黄色葡萄球菌分离株，用PCR鉴定进行进一步鉴定，结果显示，由图1可知，96株分离菌株均扩增出大约为651 bp的目的条带。测序结果与GenBank中登录的参考株的femB基因序列同源性均大于97.9%，表明分离的96株菌株为金黄色葡萄球菌。

M.DNA 标准DL 2 000;1～6.分离菌株; 7.空白对照

2.3 致病性试验结果

攻毒组的小鼠在攻毒后的2 d～5 d，出现采食量减少、精神沉郁、母鼠阴道中流出脓性分泌物，个别的小鼠没有表现出急性死亡，死亡的小鼠的体内可分离到金黄色葡萄球菌株，对照组小鼠无明显临床症状。经统计96株金黄色葡萄球菌分离菌株中72株能引起小鼠发病与死亡。

2.4 荚膜血清型鉴定结果

采用PCR对分离的72株致病性金黄色葡萄球菌分离株进行血清型鉴定，结果显示，分离的72株致病性金黄色葡萄球菌荚膜5型有38株(52.8%)，荚膜8型有23株(31.9%)，未定型有11株(15.3%)，其中以荚膜5型为该地区主要流行血清型。

2.5 药敏试验结果

用K-B 药敏纸片法对分离的72株致病性金黄色葡萄球菌分离株进行药敏试验，分析其耐药性。由表2可知，分离的72株致病性金黄色葡萄球菌对阿莫西林、氨苄西林、青霉素、庆大霉素、新霉素、强力霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、林可霉素、大观霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠9种药物耐药性较强，耐药率在58.3%～95.8%之间；对头孢噻肟、头孢噻呋、恩诺沙星、环丙沙星、氟苯尼考5种药物耐药率在11.1%～29.3%之间。

表2 药敏试验结果

3 讨论

母猪子宫内膜炎是养猪业中常见的生殖系统疾病之一，引起该病的因素众多，主要包括内源性感染和外源性感染，内源性感染主要由于母猪内源性(病毒、细菌)感染，抵抗力下降而引起的炎症，其中胎儿难产、流产及死胎等均对母猪的产道造成一定的损伤从而引起子宫内膜炎。因此，内源性疾病引发的感染也是重要诱因之一[2-4]。许多研究表明，在猪的生产中，饲养管理不当、人工授精消毒不完全、在配种时与母猪交配的公猪生殖器官有炎症等外源性感染也可以引起母猪子宫内膜炎[4-6]。金黄色葡萄球菌广泛存在于环境中，通过多种途径入侵体内引起子宫内膜炎，该菌是引起母猪子宫内膜炎主要的病原菌[1-2]。尤其在猪生产过程中，饲养管理不当、交配、助产及环境未进行消毒等都可能感染金黄色葡萄球菌，引起子宫内膜炎，且金黄色葡萄球菌对母猪存在潜在威胁，应该注重该病的综合防控。

相关研究表明，金黄色葡萄球菌具有11种血清型，其中临床中奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌以荚膜多糖5型(CP5)和8型(CP8)多见，在不同的地区流行的血清型具有一定的差异性[12]。本研究结果表明，该地区规模化猪场中致子宫内膜炎金黄色葡萄球菌以荚膜5型(52.8%)为主要流行血清型。而国内未见报道，研究结果为该地区母猪子宫内膜炎金黄色葡萄球菌流行病学及防控研究奠定了基础。

目前，临床中金黄色葡萄球菌防治主要依靠抗菌药物治疗，由于猪场抗菌药物的滥用，导致金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，其耐药性也逐年增加，给该菌的防治带来一定困难[13]。本研究表明，分离得到72株致病性金黄色葡萄球菌对临床中常用的药物产生很强的耐药性，应该引起重视。本研究与李淑红等[1]、孙龙等[14]报道的母猪子宫内膜炎金黄色葡萄球菌耐药性存在一定差异性，可能与地区及用药情况有关。金黄色葡萄球菌耐药性已经较为普遍，因此，在治疗患子宫内膜炎的病猪时一定要合理使用药物，减少耐药性产生，同时加强饲养管理，注意消毒。本研究为该地区规模化猪场致子宫内膜炎金黄色葡萄球菌的防控提供了参考。